Цены снижены! Бесплатная доставка контурной маркировки по всей России

Отсутствие осаго: нюансы, о которых стоит знать :: Autonews

Содержание

Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО

]]>

Подборка наиболее важных документов по запросу Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

Судебная практика: Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Постановление Тринадцатого арбитражного апелляционного суда от 14.06.2019 N 13АП-9116/2019 по делу N А56-110183/2018
Иск о возмещении ущерба, причиненного объектам животного мира, удовлетворен правомерно, поскольку факт гибели дикого животного (лося) от столкновения с автомобилем подтвержден актом об уничтожении объектов животного мира, в связи с чем обязанность по возмещению ущерба обоснованно возложена на лицо, застраховавшее гражданскую ответственность владельца данного транспортного средства.Ссылка СПАО «РЕСО-Гарантия» на постановление об отказе в возбуждении уголовного дела, также отклоняется судом апелляционной инстанции, поскольку из данного постановления следует, что следственными органами не устанавливался факт подделки Боровым Г.
Ю. документов (страхового полиса). Указание в данном постановлении на то, что в действиях Борового Г.Ю. усматривается административная ответственность за отсутствие полиса ОСАГО, само по себе не является доказательством, свидетельствующим о незаключении договора страхования в отношении транспортного средства Форд Фокус с VIN номером X9F4XXEED45D78553.

Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Ситуация: Что грозит собственнику за отсутствие у него документов (водительского удостоверения, полиса ОСАГО, ПТС) или за нахождение в алкогольном опьянении в припаркованном автомобиле?
(«Электронный журнал «Азбука права», 2021)Водитель автомобиля может быть привлечен к административной ответственности за управление транспортным средством при отсутствии необходимых документов (водительского удостоверения, СТС, ПТС, полиса ОСАГО) (ч.
1, 1.1 ст. 12.1, ч. 1, 2 ст. 12.3, ч. 1, 2 ст. 12.7, ч. 1, 2 ст. 12.37 КоАП РФ). Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Ситуация: Что грозит за отсутствие полиса ОСАГО?
(«Электронный журнал «Азбука права», 2021)Следует отметить, что на практике сотрудники ГИБДД могут необоснованно привлечь водителя к ответственности за неисполнение обязанности по страхованию гражданской ответственности, в том числе при условии, что полис ОСАГО оформлен, но отсутствует при себе в момент проверки документов (за что предусмотрен меньший размер штрафа).

Нормативные акты: Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Апелляционное определение Апелляционной коллегии Верховного Суда РФ от 24.03.2016 N АПЛ16-51
Частью 1 статьи 12.3 КоАП РФ установлена административная ответственность за управление транспортным средством водителем, не имеющим при себе регистрационных документов на транспортное средство, документов на право управления им, страхового полиса обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортного средства, а также за передачу управления транспортным средством лицу, не имеющему при себе документов на право управления.
Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:

Решение Верховного Суда РФ от 04.06.2007 N ГКПИ07-372
Названные нормы корреспондируются с частью 1 статьи 12.3 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, устанавливающей административную ответственность за управление транспортным средством водителем, не имеющим при себе документов на право управления им, регистрационных документов на транспортное средство, страхового полиса обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств, а равно документов, подтверждающих право владения, пользования или распоряжения управляемым им транспортным средством в отсутствие его владельца.

В 39 регионах России зафиксировано увеличение количества водителей без ОСАГО

Об этом «Югории» заявил заместитель главного государственного инспектора безопасности дорожного движения РФ Владимир Кузин, сообщила пресс-служба страховщика.

 
Так, больший рост количества штрафов за отсутствие полиса ОСАГО в первом квартале 2021 г. по сравнению с аналогичным периодом прошлого года наблюдается в Камчатском крае, Карачаево-Черкесской республике, Липецкой и Свердловской областях, Москве и Московской области, Санкт-Петербурге, республиках Ингушетия, Крым, Якутия и Калмыкия. Наибольшее число водителей без ОСАГО зафиксировано в Краснодарском крае (25296), Москве (18194), Московской области (26816), Пермском крае (13107), республиках Башкортостан (21323) и Татарстан (18723), Свердловской области (18171).

В связи с ростом в ряде регионов страны количества нарушителей, предпочитающих ездить без ОСАГО, в «Югории» также зафиксировали рост интереса клиентов к мультипродуктам, которые появляются на стыке нескольких выплатных случаев, либо при возникновении проблемной страховой ситуации у, как минимум, одной из сторон. Так уже на протяжении семи лет сохраняет популярность продукт компании «Ремонт у дилера», который в 2020 г.

был удостоен победы в номинации «Страховой продукт» Национальной банковской премии. Продукт как раз защищает тех клиентов, которые попали в ДТП с автовладельцем без ОСАГО, сообщил страховщик.

22 августа 2021 г. вступит в силу важное изменение в заключении договора ОСАГО. Страховым компаниям при заключении договора ОСАГО будет уже не важно, проходил ли автомобиль технический осмотр. Купить полис ОСАГО можно будет без этой процедуры.

«С последних тарифных реформ прошёл уже ровно год. За это время средняя стоимость полиса ОСАГО практически не изменилась по рынку, но поменялась структура: молодые и неопытные водители стали платить примерно на 20% больше, а для опытных и аккуратных страховка и наоборот стала дешевле, примерно на 10%. Думаем, что эта тенденция на рынке сохранится и в дальнейшем, — прокомментировала заместитель генерального директора «Югории» Лусине Бундакова. — Что касается «Югории», отмена проверки техосмотра на стоимость ОСАГО не повлияет и для клиентов компании точно дороже не станет».

При этом, по мнению регионального директора, водителей без техосмотра меньше не станет, так как обязанность проходить ТО у автовладельцев остается.

«За непрохождение техосмотра будут предусмотрены большие штрафы, c 1 марта 2022 г. — 2000 р. Кроме того, страховые компании по-прежнему смогут предъявлять регресс водителям, попавшим в ДТП на машинах без техосмотра, — добавила Лусине Бундакова. — Поэтому гораздо спокойнее пройти техосмотр и не нарушать закон».

Камеры не должны штрафовать за отсутствие ОСАГО до марта 2022 года

Эксперт рассказал «5 колесу», что на практике означает продление, подписанное премьер-министром Мишустиным.

Редакция

Страховые компании перестали оформлять новые полисы ОСАГО.

Официальная версия РСА – компании не могут получить данные о диагностических картах из ЕАИСТО — Единой автоматизированной системы технического осмотра.

Путаницу породило распоряжение премьер-министра Мишустина о продлении диагностических карт на полгода. Редакция «5 колеса» пообщалась с экспертом по регистрации изменений в конструкцию ТС, основателем сервиса 4-cars.ru Виталием Пелиховым. Он смог разъяснить несколько моментов. 

Продлить диагностическую карту до 01 октября по старым правилам не получится. Старой процедуры больше не будет, по крайней мере, пока не внесут изменения в законодательство. 

Если срок действия диагностической карты (ДК) заканчивается в период с 1 февраля по 1 октября 2021 года, её действие автоматически продлевается на 6 месяцев. То есть, если, например, автовладелец последний раз проходил ТО в июне 2020 года, ДК будет действительна по декабрь 2021, и в декабре нужно будет пройти процедуру техосмотра уже по новым правилам.

Если ДК закончилась до 1 февраля 2021 года и  автомобиль был выпущен  более 4 лет назад, придется пройти техосмотр по новым правилам — с фотографированием, геометками и полной проверкой по 80 пунктам.

Помните, что, например, по ГОСТу, мы не имеем право ездить без брызговиков, даже если в базовой комплектации машины их нет. И таких тонкостей — более 80 пунктов.

До 1 марта камеры не должны штрафовать за отстутсвие полисов ОСАГО. Однако, утверждать это не совсем правомерно: как настроят систему фото- и видеофиксации, непонятно. Не исключено, что камеры будут проверять номера машин по базе ЕАИСТО, где есть отметки, когда заканчивается ДК уже с учетом продления. 

Редакция рекомендует:




Хочу получать самые интересные статьи

Аспартаткарбамоилтрансфераза — обзор

14.

2.6 Некоторые примеры аллостерических ферментов, участвующих в регуляции метаболизма

Типичного механизма точного контроля метаболизма не существует. Мы уже обсудили примеры множества регуляторных процессов, большинство из которых связаны с аллостерическими ферментами.

В предыдущем разделе (14.2.5) мы рассмотрели, как участие PFK и FBPase в бесполезном цикле обеспечивает очень чувствительный механизм метаболической регуляции.Мы также увидели, как ковалентная модификация ферментов, таких как мышечная гликогенфосфорилаза, может привести к усилению регуляции. Многие другие аллостерические ферменты действуют, не участвуя в таких системах.

Аспартат-карбамоилтрансфераза (ACTase) , также называемая аспартат-транскарбамоилаза (ATCase), из E. coli была первым ферментом, в котором было показано, что активный и регуляторный сайты четко разделены. Действительно, они не только находятся в разных частях молекулы, но и находятся в разных субъединицах (рис.

14.5). Хотя это облегчило исследование характеристик фермента, это необычное открытие. Большинство аллостерических ферментов представляют собой олигомеры, состоящие из идентичных субъединиц. ACTase катализирует реакцию:

Рис. 14.5. Упрощенное представление трехмерной структуры половины (c 3 r 3 ) молекулы E. coli ACTase, как было обнаружено в исследованиях дифракции рентгеновских лучей Lipscomb et al. (1978). Активные сайты находятся на границе раздела между соседними субблоками c или рядом с ним.Другой блок c 3 r 3 находится за показанным, контакт осуществляется через r субблоков. (Условные обозначения для рис. 2.10.)

(14.10)

Это первая в последовательности реакций, приводящих к биосинтезу пиримидиновых нуклеотидов UMP, UDP, UTP и, наконец, CTP. Два важных механизма контроля регулируют образование пиримидина в E. coli : синтез АКТазы подавляется в присутствии урацила, а конечный продукт метаболизма, ЦТФ, контролирует свой собственный синтез путем обратного ингибирования АКТазы. Джон Герхарт и Артур Парди (1962) показали, что ЦТФ увеличивает сигмоидальную природу графика Михаэлиса-Ментен для реакции, катализируемой АКТазой, при этом V max не изменяется, тогда как активатор АТФ (пуриновый нуклеотид) снижает сигмоидальную природу кривой. Исходя из этого, они и другие разработали концепцию аллостерической регуляции.

Герхарт вместе с Говардом Шахманом диссоциировал фермент под действием p -меркурибензоата и показал, что один тип субъединицы (c) обладает всей каталитической активностью, а другой (r) содержит регуляторные сайты.Реакция, катализируемая в отсутствие регуляторных субъединиц, демонстрирует гиперболические характеристики и не зависит от АТФ или CTP.

Анализ последовательности Клаусом Вебером (1968) и исследования дифракции рентгеновских лучей Уильямом Липскомбом и сотрудниками (1968 и последующие годы) показали, что структура холофермента c 3 (r 2 ) 3 c 3 , два каталитических тримера (каждый по M r 100 000), разделенные тремя регуляторными димерами (каждый по M r 33 000). Структурная целостность холофермента стабилизируется ионами Zn 2+ (рис. 14.5).

Каждый регуляторный димер может связывать две молекулы CTP, но, хотя две субъединицы очевидно идентичны, сродство к первой молекуле CTP значительно выше, чем ко второй. Точного объяснения этой отрицательной гомотропной кооперативности еще предстоит найти. Также известно, что АТФ и CTP конкурируют за один и тот же сайт, вероятно, вызывая разные конформационные изменения при связывании.

Данные измерений остановленного потока и релаксации предполагают, что гомотропные взаимодействия (между каталитическими сайтами) включают согласованный механизм, тогда как гетеротропные взаимодействия (между каталитическими и регуляторными сайтами) включают механизм, который является последовательным. Впоследствии, в 1980-х годах, Эван Кантровиц, Уильям Липскомб и его коллеги использовали рентгеновскую кристаллографию и сайт-направленный мутагенез, чтобы продвинуться дальше. Выяснилось, что каждая каталитическая субъединица имеет отдельные домены для связывания субстратов аспартата и карбамоилфосфата, которые в Т-состоянии дальше друг от друга, чем в R-состоянии. Кроме того, в первом состоянии петля (остатки 230-245) каждой каталитической субблока образует связи с субблоком в каталитическом тримере напротив. В частности, глутамат-239 в петле взаимодействует как с лизином-164, так и с тирозином-165 в другой субъединице, чей глутамат-239, в свою очередь, взаимодействует с лизином-164 и тирозином-165 в первой субъединице. Для молекулы в целом происходит три таких набора взаимодействий, удерживающих два каталитических тримера близко друг к другу и затрудняющих доступ к активным центрам.Ни одно из этих взаимодействий не присутствует в R-состоянии, что позволяет тримерам раздвигаться и облегчать доступ к субстрату. Кроме того, аспартатный и карбамоилфосфатный домены каждой каталитической субъединицы сближены из-за взаимодействия между глутаматом-50 и аргинином-167 и аргинином-234, а также между серином-171 и глутамином-133 и гистидином-134. , помогая создать активный карман сайта. По этим и другим причинам R-состояние обладает гораздо большей каталитической активностью, чем T-состояние, и переход от T-состояния к R-состоянию происходит согласованным образом.

Модификаторы большинства аллостерических ферментов представляют собой относительно небольшие молекулы. Однако лактозосинтаза (раздел 5.2.3) является исключением. Хотя модификатор α-лактальбумин можно рассматривать как субъединицу фермента, он слабо связывается с другим белковым компонентом ( N -ацетилактозаминсинтаза / галактозилтрансфераза), но при этом полностью меняет специфичность фермент, позволяющий глюкозе действовать как субстрат. Джон Моррисон и Курт Эбнер (1971) на основании своих исследований пришли к выводу, что реакция протекает по механизму принудительного порядка, а именно:

(14.11)

Boopathy Ramakrishnan и Pradman Qasba (2001-3) показали, что связывание UDP-галактозы приводит к конформационным изменениям в активном центре фермента. В отсутствие α-лактальбумина глюкоза может связываться только временно, но она образует водородные связи с α-лактальбумином, если он присутствует, стимулируя дальнейшие корректировки активного сайта, которые максимизируют взаимодействие с глюкозой. Таким образом, молекула удерживается в подходящей ориентации достаточно долго для образования лактозы.

Мультиферментный комплекс пируватдегидрогеназы из E.coli (см. разделы 5.2.5 и 11.5.6) подлежит ингибированию конкурентным продуктом НАДН и ацетил-КоА. Кроме того, компонент E 1 может быть активирован AMP и заблокирован GTP. Регуляция системы млекопитающих имеет сходные особенности, но более сложна, чем в E. coli : участвует ковалентная модификация, при этом в комплексе присутствуют ферменты киназа и фосфатаза . Лестер Рид (1974) показал, что киназа, связанная с ацетилтрансферазой (E 2 ), инактивирует комплекс, катализируя фосфорилирование серинового остатка в пируватдегидрогеназном компоненте (E 1 ).Эта киназа сама активируется ацетил-КоА и НАДН и ингибируется АДФ и пируватом. Фосфатаза, которая катализирует удаление этого фосфата, активируется Ca 2+ и Mg 2+ . Таким образом, повышенные соотношения [ATP] / [ADP], [NADH] / [NAD + ] и [acetyl-CoA] / [CoΔSH] в митохондриях, где расположен комплекс, будут иметь тенденцию к снижению его общей активности. Ситуация в таком мультиферментном комплексе, где метаболит передается непосредственно от одного фермента к другому, кажется идеальной для чувствительной регуляции метаболизма.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

CTP способствует эффективной ParB-зависимой конденсации ДНК, облегчая одномерную диффузию из parS

Существенные изменения:

Хотя рецензенты и рецензирующий редактор согласились с тем, что это очень тщательное, тщательно проведенное и важное исследование, они определили ряд проблем, которые необходимо решить:

1. Все рецензенты соглашаются с тем, что, если это возможно с разумными усилиями, авторы должны предоставить некоторые прямые данные о диффузии одиночных молекул, поскольку представленные данные подтверждают предложенное поведение, но не исключают все альтернативы.

Чтобы ответить на этот вопрос, мы изготовили биотинилированную версию ParB, которая будет помечена QD-стрептавидином. Мечение QD увеличивало интенсивность флуоресценции отдельного белка ParB и позволяло значительно увеличить время визуализации из-за отсутствия фотообесцвечивания. Мы также изготовили подложки, содержащие только 7 или 2 копии parS, чтобы увеличить наши шансы наблюдать отдельные события. Нам удалось наблюдать одномерную диффузию отдельных молекул ParB вдоль ДНК.Кимографы также показали четкое стабильное связывание на сайтах parS, что подтверждает наши предыдущие выводы. Мы разработали новое программное обеспечение для анализа этих кимографов и извлечения индивидуальных временных курсов ParB (то есть положения ParB вдоль ДНК в зависимости от времени). Кроме того, были рассчитаны константы диффузии для отдельных траекторий. Константа диффузии ParB составляла 0,41 ± 0,02 мкм2 с -1 (среднее ± среднеквадратичное, n = 177) или 3,5 ± 0,2 kbp2 с -1 , учитывая рост на пару оснований на 0,34 нм. Эти данные согласуются с предыдущими экспериментами с одной молекулой, проведенными в отсутствие CTP (Graham et al., 2014) и с недавно рассчитанной константой диффузии ParB 0,7 мкм2 с -1 с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения (Guilhas et al., 2020).

Эти новые данные прямо подтверждают наш вывод о распространении ParB с сайтов parS. Кроме того, теперь мы обеспечиваем измерение константы диффузии ParB в условиях CTP и CTPγS. Кроме того, мы также показываем, что часто белки ParB покидают ДНК из неспецифической области.

Все эти новые результаты были включены в новый раздел результатов, озаглавленный «Прямая визуализация распространения ParB из последовательностей parS», а также в новый рисунок 3 и рисунок 3 — дополнение к рисунку 1, что привело к изменению маркировки последующих рисунков.В обновленную рукопись также были включены новые разделы методов, касающиеся биотинилирования ParB, конъюгации с квантовыми точками и расчета констант диффузии.

2. Данные показывают, что несколько сайтов parS необходимы для конденсации ДНК в представленных экспериментах, в то время как в B. subtilis один сайт parS оказывается достаточным для всех функций, что потенциально подразумевает, что конденсация ДНК не важна. Авторы открыто признают это и предлагают два объяснения (стр. 10), включая различия в концентрации ParB и условиях раствора.Выводы рукописи будут значительно укреплены, если авторы смогут варьировать эти параметры и определять условия, которые могут позволить (ограниченную) конденсацию ДНК с одним сайтом parS.

Теперь мы рассмотрели вопрос о количестве последовательностей parS, необходимых для уплотнения, несколькими способами. Во-первых, мы изготовили субстраты с C-ловушкой, содержащие только 7 или 2 копии parS, и повторили эксперименты с C-ловушкой с этими новыми субстратами. По сути, мы воспроизвели те же результаты, что и с ДНК 39x parS, и наши эксперименты по диффузии проводились с использованием этих новых субстратов (см. Также выше).

Наши данные показывают прямую корреляцию между силами конденсации и количеством последовательностей parS в экспериментах МТ. Как отметил рецензент, мы наблюдаем, что минимальное количество parS требуется для наблюдения конденсации в экспериментах МТ. Мы объясняем это тем фактом, что эти эксперименты всегда проводятся при наличии тянущей силы, которой может быть достаточно для предотвращения конденсации, если сила конденсации мала. Чтобы проверить эту гипотезу, мы также провели эксперименты в отсутствие тянущих сил, используя метод привязанного движения частиц (TPM) и атомно-силовую микроскопию (AFM).

Сначала мы использовали TPM для определения среднеквадратичных отклонений гранулы, параметра, коррелирующего с длиной контура ДНК. Мы сделали подходящую для экспериментов с TPM молекулу ДНК размером ~ 1700 п.н., содержащую один parS. В присутствии CTP мы наблюдали сильное уменьшение RMS-экскурсий, согласующихся с конденсацией ДНК. Тот же эксперимент, проведенный без CTP или с зашифрованной ДНК parS, не уменьшил отклонения RMS. Эти эксперименты включены в новое приложение 1. к рисунку 6.

Кроме того, мы использовали АСМ для изображения кольцевых молекул ДНК, содержащих ноль или один сайт parS, инкубированных в различных экспериментальных условиях.В отсутствие CTP молекулы ДНК и белки ParB оказывались монодисперсными на поверхности слюды. В присутствии CTP и только при использовании субстрата ДНК single-parS мы наблюдали кластеризацию и конденсацию участков ДНК, предположительно участка parS. Эти эксперименты включены в новое приложение к рис. 6 2. Вместе эти эксперименты подтверждают, что взаимодействия ParB приводят к конденсации ДНК и что для конденсации ДНК достаточно одного parS.

К рукописи добавлен новый текст, объясняющий эти эксперименты.Также были добавлены дополнительные методы и рисунки.

3. Обратитесь к дополнительным комментариям в индивидуальных обзорах.

Мы учли дополнительные комментарии отдельных рецензентов ниже. Рецензент №1:

Это исследование исследует, как недавно обнаруженная активность CTPase бактериального ParB способствует разделению ParS-содержащих сестринских хромосом в системе ParABS. Используя визуализацию флуоресценции, авторы непосредственно визуализировали связывание ParB с ParS, а также диффузное распространение белка по ДНК.Кроме того, они систематически и всесторонне исследовали, при каких условиях была получена ParB-опосредованная конденсация ДНК, которая считается необходимой для сегрегации хромосом. Данные авторов убедительно показывают, что связывание CTP с помощью ParB стимулирует его ассоциацию с ParS и, что наиболее важно, способствует его диффузному распространению от ParS. Диффузионное распространение по контуру ДНК было продемонстрировано с помощью белковых барьеров. Это обеспечивает достаточное доказательство диффузии белка по контуру ДНК, хотя авт. Не достигли прямой визуализации диффузии одиночных комплексов ParB вдоль ДНК.Тестируя широкий диапазон условий (концентрация ParB, присутствие Mg 2+ , гидролизуемый и не-CTP, количество сайтов ParS), авторы продемонстрировали, что связывания CTP, а не гидолиза достаточно для ParB, чтобы способствовать конденсации ДНК. Два разных типа наблюдений вместе показывают, что CTP-обеспечиваемое диффузное распространение ParB из ParS управляет последующей конденсацией ДНК. Более того, эксперименты по наномеханической конденсации ДНК вместе с комбинированной прямой флуоресцентной визуализацией представляют собой полезное методологическое развитие для будущих исследований этой системы.В целом представленная работа является ясным и всесторонним исследованием, которое предоставляет прямые и недвусмысленные доказательства недавно предложенных моделей ParB-опосредованной конденсации ДНК и ее стимуляции с помощью ParS и CTP.

1) Учитывая потенциал используемой установки C-ловушки, было бы очень интересно непосредственно наблюдать одномерную диффузию отдельных комплексов ParB вдоль ДНК. Могли ли авторы с легкостью получить такие данные, а если нет, то что мешало наблюдению одиночных молекул? Знание о константе диффузии / коэффициенте трения потенциально может помочь понять, как свободно диффундирующие комплексы могут способствовать конденсации ДНК.

Мы полностью согласны с рецензентом, и фактически мы работали над этой целью, пока статья находилась на рецензировании. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

В свете этих новых данных диффузии становится ясно, что в экспериментах с МТ белки ParB присутствуют вокруг неспецифической области субстрата ДНК. Однако высокая сдерживающая сила предотвращает их межмолекулярные взаимодействия.Мы предполагаем, что уменьшение силы приводит к появлению дистальных сегментов ДНК, которые стабилизируются посредством взаимодействий ParB-ParB, что приводит к конденсации ДНК.

2) Предполагая, что комплексы ParB быстро диффундируют по ДНК, как авторы предполагают, что конденсации будут способствовать такие белки, у которых отсутствует какой-либо якорь (см. Также 1)? Может ли взаимодействие с другими комплексами ParB при образовании петли подавлять подвижность комплексов ParB? Пожалуйста, добавьте короткое обсуждение.

Наши данные подтверждают модель, в которой белки ParB диффундируют с сайтов parS.Это должно приводить к присутствию нескольких ParBs на неспецифическом участке ДНК, в то время как молекула удерживается силами, недопустимыми для конденсации (как мы видим в экспериментах с C-ловушкой, Рисунок 1 и Рисунок 2). Дальнейшее уменьшение силы (как мы делаем в экспериментах с МТ) сближает удаленные белки, что приводит к образованию петель, что в конечном итоге приводит к конденсации ДНК. Конечно, эта модель конденсации требует межмолекулярных взаимодействий, которые могут исходить от CTD или NTD ParB, но мы не видим необходимости в том, чтобы белки закреплялись на неспецифических сайтах.В конечном счете, моделирование может пролить свет на этот момент, но это выходит за рамки данной работы.

Мы добавили текст в обсуждение по этому поводу.

3) Авторы показывают, что связывание CTP, а не гидролиз необходимо для содействия диффузному распространению и конденсации ДНК. Таким образом, роль гидролиза CTP остается неясной. Я мог представить, что гидролиз может стимулировать высвобождение ParB из ДНК и, таким образом, потенциально силы деконденсации конденсированной ДНК.Авторы апробировали такой сценарий?

Наши новые эксперименты с C-ловушкой показывают, что часто ParB отделяется от неспецифической ДНК после диффузии с участков parS. Это согласуется с предыдущими моделями, предполагающими, что именно гидролиз CTP способствует высвобождению ParB из ДНК. Мы пытались измерить время жизни ParB на неспецифической ДНК в условиях CTP и CTPγS, но наши результаты не были окончательными, и это предмет для будущей работы. Измерение сил деконденсации в экспериментах МТ затруднено, поскольку мы обнаружили, что они зависят от уровня предыдущего уплотнения и потенциального неспецифического прикрепления конденсата к поверхности стекла.

4) Авторы также должны предоставить профиль флуоресценции в отсутствие CTP на Рисунке 1C, приложение 4.

Теперь мы добавили усредненный по времени профиль отсутствия CTP в приложении 4 к рисунку 1C.

Рецензент № 2:

В этой рукописи исследуется связывание и конденсация ДНК parS с помощью белка B. subtilis ParB в экспериментах с одной молекулой с использованием оптических ловушек и магнитного пинцета. Работа является продолжением недавнего открытия способности ParB связывать и гидролизовать CTP.Авторы показывают, что добавление CTP стимулирует связывание ParB с молекулами ДНК, несущими кластерные сайты parS, и способствует распространению ParB на соседнюю ДНК. Более того, показано, что связывание ParB приводит к конденсации ДНК с кластерными сайтами parS, опять же, активность, которая стимулируется CTP или негидролизуемым аналогом CTPgS.

В то время как в работе тщательно наблюдают и описывают активность ParB in vitro и сообщают о выводах, которые в значительной степени согласуются с недавними публикациями, потенциальная слабость исследования касается использования искусственно сгруппированных сайтов parS на тестовых субстратах ДНК и отсутствия аналогичной активности на других объектах. природные субстраты с одним участком parS, что в совокупности вызывает сомнения в физиологической значимости открытий.

сайтов parS широко рассредоточены в геноме B. subtilis (10 сайтов в ~ 1 мегабайтах), причем два ближайших сайта разделены примерно на 10 килобайт. Более того, одного сайта parS достаточно, чтобы поддерживать сегрегацию хромосом и способствовать нормальному формированию ParB фокуса. Ясно, что кластеризация сайтов parS не имеет решающего значения in vivo. Тем не менее, действия, обнаруженные в этой работе, по-видимому, строго зависят от кластеризации parS. Таким образом, неясно, действительно ли конденсация ДНК с помощью ParB, как здесь описано, происходит in vivo и имеет ли она отношение к функции ParB.

Чтобы решить проблему кластеризации parS, мы изготовили две новые подложки C-trap, содержащие 7 и 2 копии parS (новый рисунок 2, дополнение 1A, новый рисунок 3 и новый рисунок 3, приложение 1). По сути, мы получили те же результаты, что и с 39x parS, исключая эффект кластеризации parS. Эксперименты с QD-меченным ParB показали стабильное связывание с отдельными сайтами parS и позволили нам непосредственно наблюдать диффузию белков ParB вдоль неспецифической ДНК. Дальнейшие эксперименты с использованием метода TPM (новый рисунок 6, приложение 1) и AFM (новый рисунок 6, приложение 2) с субстратами с одним parS подтвердили CTP-зависимую конденсацию ДНК.Таким образом, все эти новые эксперименты показывают, что кластеризация parS не требуется для конденсации.

В родственном препринте (Taylor et al., 2021) сообщается о подобной конденсации ДНК с использованием плазмиды F ParB. Однако в этом случае кластерные сайты parS естественным образом обнаруживаются на соответствующей ДНК, плазмиде F. Таким образом, конденсация ДНК наблюдалась только с кластерными сайтами parS. Это следует обсудить и дополнительно изучить.

Мы наблюдали прямую корреляцию между силами конденсации и количеством последовательностей parS в экспериментах МТ.Мы также заметили, что минимальное количество parS требовалось для наблюдения конденсации в экспериментах МТ. Мы объясняем это тем фактом, что эти эксперименты всегда проводятся при наличии тянущей силы, которой может быть достаточно для предотвращения конденсации, если сила конденсации мала. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели эксперименты в отсутствие тянущих сил, используя метод привязанного движения частиц (TPM) и методы атомно-силовой микроскопии (AFM). провели эксперименты в отсутствие тянущих сил, используя метод привязанного движения частиц (TPM) и методы атомно-силовой микроскопии (AFM).

Сначала мы использовали метод TPM для определения среднеквадратичных отклонений бусинки, параметра, коррелирующего с длиной контура ДНК. Мы изготовили молекулу ДНК, подходящую для экспериментов с TPM, размером ~ 1700 п.н., содержащую один parS. В присутствии CTP мы наблюдали сильное уменьшение экскурсий RMS, согласующееся с конденсацией ДНК. Тот же эксперимент, проведенный без CTP или с зашифрованной ДНК parS, не уменьшил отклонения RMS. Эти эксперименты включены в новое приложение 1 к рисунку 6.

Кроме того, мы использовали АСМ для изображения кольцевых молекул ДНК с или без одного сайта parS, инкубированных в различных экспериментальных условиях. В отсутствие CTP молекулы ДНК и белки ParB оказывались монодисперсными на поверхности слюды. В присутствии CTP и только при использовании субстрата ДНК single-parS мы наблюдали кластеризацию и конденсацию вокруг области ДНК, предположительно области parS. Эти эксперименты включены в новое приложение 2 к рисунку 6.

Вместе эти эксперименты подтверждают, что взаимодействия ParB приводят к конденсации ДНК и что одного parS достаточно для конденсации ДНК.

К рукописи добавлен новый текст, объясняющий эти эксперименты. Также были добавлены дополнительные методы и рисунки.

Авторы утверждают, что они могут напрямую обнаруживать связывание ParB с parS («первая визуализация специфического связывания ParB с parS»). Однако их анализ не делает различий между ParB, связанным с parS, и 1D, диффундирующим ParB. Этот вопрос особенно важен, поскольку недавние исследования фактически показали, что ParB только временно связывает parS во время цикла гидролиза CTP (Jalal et al., 2020; Сох и др., 2019). Могут ли авторы различать привязку и смещение parS с помощью одного сайта parS и препятствий EcoRI?

Это важный момент, который также поднимали другие рецензенты. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

ParB-AF488 демонстрирует сильно сниженную активность CTPase (приложение к рисунку 1). Это связано с мутацией цистеина или с флуоресцентной меткой? Результаты необходимо подтвердить с использованием белка с другой меткой (другого цистеина или другого флуорофора в зависимости от того, что вызывает снижение активности).

Мы согласны с рецензентом в том, что ParB-AF488 имеет пониженную активность CTPase, о чем мы прозрачно сообщали в нашей первоначальной заявке. Это снижение не объясняется ошибками количественного определения белка из-за наличия метки, поскольку спектроскопические и гелевые методы оценки концентрации белка хорошо согласуются (данные не показаны). Может случиться так, что часть белка инактивирована в результате длительной процедуры мечения (рецензент сравнивает меченый белок с необработанным белком дикого типа, а не с ложно-меченым белком).

В любом случае очевидный эффект на связывание CTPase и ДНК менее чем в 2 раза (исходная статья и изображение ответа автора 1), а связывание ДНК стимулирует активность CTPase в той же степени, что и для дикого типа (исходная статья). Эти данные предполагают, что мечение вызывает минимальное нарушение активных центров фермента. Таким образом, мы со всем уважением не согласны с тем, что активность этого белка «серьезно снижается» из-за маркировки. Мы принимаем и признаем, что поведение нарушается диким типом, как это имеет место во многих исследованиях отдельных молекул с использованием флуоресцентно меченых белков.

Важно отметить, что это небольшое количественное изменение скорости оборота ОСАГО не влияет на наши выводы. Наша работа сосредоточена на больших и качественных эффектах CTP на поведение белка, и они согласуются во всех экспериментах, в которых используются препараты как меченых (C-ловушка), так и немеченых (MT, TPM, AFM). Во всех случаях мы контролируем эти CTP-зависимые эффекты, проводя эксперименты в отсутствие нуклеотидов или в присутствии негидролизуемых аналогов или CDP.

Репрезентативные TBM- и TBE-EMSA, оценивающие связывание
parS (A и B) и неспецифическую ДНК-связывающую активность (C), соответственно, меченного Alexa-488-ParB и его предшественника ParBS68C.

Сохраняется специфическая и неспецифическая ДНК-связывающая активность, подобная дикому типу. Обнаружение флуоресцентного белка в геле соответствует структуре нуклеопротеидных комплексов.

Рецензент № 3:

ParBs связываются с центромерным сайтом, называемым parS, с образованием больших конденсированных комплексов, в которых ParBs, как наблюдают, распространяются на многие bp от parS, но механизмы распространения являются предметом обсуждения. Настоящее исследование основано на недавних открытиях, что ParB связывают и гидролизуют CTP, и что CTP способствует распространению. Здесь авторы непосредственно визуализируют флуоресцентные ParB, связанные с parS на ДНК, которая растянута, потому что она привязана на обоих концах.Они исследуют конденсацию с помощью магнитного пинцета на ДНК, привязанной к одному концу и притягиваемой магнитом на другом конце. Они обнаружили, что CTP действительно способствует parS-специфическому связыванию и распространению ДНК, и эта активность требует CTP, но не гидролиза. Результаты расширяют их предыдущие опубликованные анализы в отсутствие CTP, в которых авторы наблюдали распространение, но оно не было специфичным для parS и требовало более высоких концентраций ParB. Их результаты повторяют многие свойства распространения, которые наблюдались in vivo, включая специфичность для parS и влияние препятствий.Результаты согласуются с моделью, предложенной Soh et al. (2019), в которых CTP блокирует ParB в качестве зажима вокруг ДНК, способствуя самоассоциации N-концевого домена, и что после зажима он скользит по ДНК от parS; то есть скольжение предлагается в качестве механизма растекания. Однако результаты также согласуются с распространением за счет кооперативного взаимодействия ParB с теми, которые связаны рядом с ними, поэтому эти данные не поддерживают прямое скольжение, исключая другие альтернативы. Поскольку это различие не разрешается текущими результатами, можно рассматривать эти результаты как подтверждающие.Однако эти результаты имеют важное значение. Как утверждают авторы, это первый случай, когда связывание молекулы ParB с линейной ДНК на и вокруг parS было непосредственно визуализировано в исследованиях отдельных молекул; то есть с разрешением для parS по сравнению с близко расположенными регионами. Возможность просматривать комплексы непосредственно в этом разрешении на ДНК непосредственно проверяет локализацию ParB / parS и влияние распространяющихся препятствий. Во-вторых, специфичность для parS (или ее отсутствие) долгое время была проблемой для исследования in vitro связывания ParB с parS в биофизических экспериментах.Также авт. Показывают, что скольжение по-прежнему предпочитает находиться близко к области parS (она не «свободна»), указывая тем самым, что латеральные (и, возможно, мостиковые) белок-белковые взаимодействия играют роль в сложной архитектуре.

1. Рисунок 2G: Подходящим контролем является тот же эксперимент без EcoRI, который должен быть включен. В противном случае мы вынуждены сравнивать разные субстраты ДНК с этим и с предыдущими рисунками.

Следуя предложению рецензента, мы провели контрольный эксперимент без мутанта EcoRI (изображение ответа автора 2).Как и ожидалось, блокировки не наблюдалось. Обратите внимание, что включение профиля на рис. 2G неуместно, потому что молекулы разные, с разной интенсивностью флуоресценции и ориентацией. Мы включили предложение в основной текст, указывающее, что этот результат не показан.

ParB распространяется в отсутствие препятствий EcoRI с использованием C-ловушки EcoRI 39x
parS ДНК.

2. Вверху страницы 7: «предполагает, что это происходит при скольжении из parS». Хотя авторы явно предпочитают модель скользящего зажима (как и я), их данные не касаются того, является ли скользящее или латеральное рекрутирование белок-белок ответственным за распространение в этих экспериментах. Ключевое различие состоит в том, были ли молекулы ParB, которые распространились на соседнюю ДНК, загружались по parS или просто рядом с другими ParB в том, что они называют «ближним распространением».Контрольно-пропускные пункты также подходят для скольжения, но другие модели также могут их приспособить.

Это важный момент, который также поднимали другие рецензенты. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

3. Страница 2 и в других местах: «Абсолютное требование для связывания CTP, но не для гидролиза». Авторы не тестировали CDP, хотя Soh et al. показали, что CDP действительно способствует сходной N-концевой самоассоциации, которая стимулируется CTP.Это важная часть модели; работает ли CDP или белок должен находиться в апо-форме, чтобы диссоциировать от ДНК. Авторы тестировали CDP? Если да, эти данные могут быть включены. Если нет, следует обсудить CDP.

Следуя предложению рецензента, мы провели эксперименты с C-ловушкой и MT с использованием CDP. Наши результаты показали связывание ParB с parS на уровнях, аналогичных условию отсутствия нуклеотидов (изображение ответа автора 3), и отсутствие диффузии из parS. Как и ожидалось, конденсации ДНК не наблюдали в условиях CDP (изображение ответа автора 3).Это подтверждает наш вывод, что именно связывание CTP, а не гидролиз усиливает связывание ParB с parS и способствует диффузии ParB из parS и конденсации.

(слева) Сканирование C-ловушки, показывающее связывание ParB с
parS на уровнях, аналогичных Apo-форме ParB, а не диффузию из parS .

(справа) Динамика MT, показывающая отсутствие конденсации в присутствии CDP и Mg 2+ .

Мы включили профиль интенсивности флуоресценции, соответствующий состоянию CDP, на рис. 2C. Мы также включили эксперимент MT, показывающий отсутствие конденсации, как новый рисунок 5C. Эти новые результаты описаны и прокомментированы в основном тексте.

4. Рис. 1-S1C: правые 3 столбца выглядят неправильно маркированными, потому что они идентичны 3 средним столбцам, как указано. Они с ОСАГО?

Спасибо, что указали на эту опечатку.В самом деле, он должен и теперь читает CTPγS.

5. Рисунок 1-S4: что такое время = 0? Включите возбуждение?

Да, время = 0 соответствует включению возбуждения. Мы включили это предложение в заголовок рисунка 1-S4D.

Рецензент № 4:

Francisco et al. исследовать роль CTP и гидролиза в связывании ParB с последовательностью parS и неспецифической ДНК на уровне одной молекулы. Используя оптический пинцет, они показывают специфическое связывание ParB с сайтами parS и демонстрируют, что этот процесс усиливается присутствием CTP или CTPγS.Они обнаружили, что белки ParB с более низкой плотностью также обнаруживаются в дистальной неспецифической ДНК в присутствии parS, и что распространение ParB ограничивается белковыми препятствиями. Кроме того, с помощью магнитного пинцета они показали, что молекулы ДНК, содержащие parS, конденсируются с помощью ParB при наномолярной концентрации белка, что требует связывания CTP, но не гидролиза. Эти находки показывают важность CTP-зависимого распространения ParB и влияют на понимание механизма образования мостиков и конденсации ДНК сетями ParB.

Основываясь на этих результатах, авт. Предлагают модель ParB-обеспечиваемой конденсации ДНК, которая требует одномерного скольжения ParB вдоль ДНК от сайтов parS. В целом эксперименты проводились тщательно и тщательно контролировались. В рукописи содержится критическая информация, которую можно усилить, решив следующие проблемы:

1. Наблюдали ли авторы диффузию изолированных фокусов ParB вдоль ДНК? Это станет убедительным доказательством предлагаемой модели диффузии / скольжения.

Это важный момент, который также поднимали другие рецензенты. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

2. На основе модели скользящего зажима, распространение и диффузия ParB приводят к конденсации ДНК за счет образования больших петель ДНК. Можно ли показать динамическое распространение ParB при сохранении того же количества ParB на ДНК? Например, могут ли авторы инкубировать ParB-содержащую ДНК в канале 4 (канал ParB) в определенное время для загрузки ParB на сайты parS, а затем переместить ее в буферный канал без свободного ParB, а также с CTP или CTPγS, где изображения получены с длительным интервалом времени, чтобы минимизировать фотообесцвечивание.Можно проанализировать интенсивность флуоресценции ParB во время процесса распространения. Если интенсивность остается постоянной в результате распространения в присутствии CTPγS, но значительно снижается в присутствии CTP, эти данные убедительно демонстрируют предложенный механизм распространения и зависимого от гидролиза диссоциации CTP.

Мы благодарим рецензента за эти предложения, подтверждающие распространение. Тем не менее, мы решили следовать альтернативной стратегии, основанной на прямой визуализации QD-меченного ParB.Как описано выше, эта стратегия сработала, и мы непосредственно визуализировали распространение ParB с сайтов parS.

3. На рисунке 2 авторы показывают, что распространение ParB может быть заблокировано EcoRI. Могут ли авторы показать, что EcoRI связан в позициях специфичности? Распространяющаяся блокировка белковыми препятствиями, показанная в экспериментах с оптическим пинцетом, потенциально указывает на то, что препятствия могут влиять на конденсацию ДНК. Могут ли авторы применить магнитный пинцет, чтобы показать влияние белковых барьеров на конденсацию ДНК in vitro?

Хорошо известно, что EcoRI имеет чрезвычайно высокое сродство и специфичность к своему сайту (Terry et al., 1983), и, поскольку у нас нет меченого мутанта EcoRI, наши эксперименты предполагают, что сайты заняты. Это одна из причин, по которой в наших экспериментах мы использовали несколько сайтов. Тем не менее, мы проверили влияние белковых барьеров на конденсацию в экспериментах с МТ. Мы обнаружили частичную концентрацию, совместимую с блокированием распространения ParB из parS (Рисунок 7, приложение 1).

Список литературы

Брейер А.М., Гроссман А.Д. 2007. Полногеномный анализ белка разделения хромосом и споруляции Spo0J (ParB) выявляет участки распространения и исходно-дистальные участки на хромосоме Bacillus subtilis . Mol Microbiol 64: 703–718. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2007.05690.x

Graham TG, Wang X, Song D, Etson CM, van Oijen AM, Rudner DZ, Loparo JJ. 2014. Распространение ParB требует образования мостиков ДНК. Genes Dev 28: 1228–1238. DOI: 10.1101 / gad.242206.114

Гильяс Б., Уолтер Дж. С., Рех Дж., Дэвид Дж., Валлисер Н. О., Палмери Дж., Матье-Демазьер С., Пармеджиани А., Буэ Дж. Ю., Ле Галль А., Нолльманн М. 2020. Разделение конденсатов жидкой фазы в бактериях под действием АТФ. Mol Cell 79: 293-303.e4. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.molcel.2020.06.034

Livny J, Yamaichi Y, Waldor MK. 2007. Распределение центромер-подобных сайтов parS у бактерий: выводы из сравнительной геномики. Дж. Бактериол 189: 8693–8703. DOI: 10.1128 / JB.01239-07

Терри Б.Дж., Джек В.Е., Рубин Р.А., Модрич П. 1983. Термодинамические параметры, регулирующие взаимодействие эндонуклеазы EcoRI со специфическими и неспецифическими последовательностями ДНК. J Biol Chem 258: 9820–9825.

https: // doi.org / 10.7554 / eLife.67554.sa2

CTP и parS координируют динамику комплекса разделения ParB и активацию ParA-ATPase для ParABS-опосредованного разделения ДНК

Существенных изменений:

1) Взаимодействие между ParBF и самим CTP (при наличии / отсутствии parSF) не получило особого внимания со стороны авторов. Насколько сильно ParBF связывается с CTP? Связывает ли ParBF CTP в отсутствие parSF? Насколько быстро ParBF гидролизует CTP в присутствии / в отсутствие parSF? Эта информация очень важна для полной оценки результатов в этой рукописи, особенно тех, где присутствуют все компоненты: ParAF, ParBF, ATPyS, CTP, parSF.(Некоторая первоначальная информация уже есть в Soh et al.2019, но это были предварительные наблюдения.)

Спасибо, что указали на эту проблему. У нас были предварительные данные об активности CTPase ParB F ​​, но не было данных для публикации. Мы выполнили новый набор измерений CTPase в присутствии и в отсутствие parS F ​​ , чтобы оценить кажущееся CTP K M и k cat , которые теперь представлены на рисунке 5 — дополнение к рисунку 2 и описан на стр. 15, строки 295–304 (номера строк предназначены для просмотра макета печати без отображения разметки).

Мы также очень заинтересованы в характеристике активности CTPase ParB F ​​ в присутствии ParA F ​​ и других кофакторов. Однако мы хотим подойти к этой теме систематически, если возможно, включая изучение активности ParB CTPase в присутствии гидролиза АТФ с помощью ParA. Однако, поскольку g- 32 P-CTP недоступен (и удаление загрязняющего CDP из a- 32 P-CTP непросто по сравнению с удалением π из g- 32 P-ATP, как это делается для наш субстрат для анализа АТФазы), в настоящее время мы изучаем доступные нам технические возможности.Завершение этого проекта в текущих рабочих условиях потребует значительного времени, а включение этого исследования не только вызовет длительную задержку публикации текущей рукописи, но и сделает ее чрезмерно долгой. Поэтому мы планируем провести отдельное комплексное исследование, которое будет опубликовано в следующем документе.

2) Согласно представленной модели, стехиометрия взаимодействий ParA-ParB в присутствии CTP и / или parS может быть изменена путем обеспечения дополнительной гибкости связи между N-концевым ParA-взаимодействующим пептидом в ParB и ParB CTP. домен.Если действительно стехиометрия является критической, то ожидается, что такие мутанты ParB будут иметь дефекты разделения плазмиды. Если этот эксперимент может быть выполнен, было бы важно показать, как он будет иметь прямое отношение к наиболее важному открытию в этой рукописи, то есть стехиометрии взаимодействия ParA-B +/- CTP.

Спасибо, что указали на этот важный тест представленной здесь модели. Мы действительно рассматривали возможность создания таких искусственных мутантов, чтобы подтвердить эту гипотезу.

Однако N-концевые области плазмид ParB, такие как F или P1, длиннее хромосомных ParB, и граница между доменом взаимодействия ParA и доменом CTPase остается несколько неоднозначной, что требует проведения нескольких предварительных экспериментов, прежде чем мы сможем завершить дизайн. мутантного белка. Поскольку наши возможности по проведению экспериментов все еще ограничены, включение этих экспериментов в текущую рукопись вызовет существенную задержку публикации. В исправленную рукопись мы включили прогнозы для таких мутантов и представили обзор наших будущих планов в отношении этих мутантов в разделе «Обсуждение» (стр. 27, строки 535-540).

Другие серьезные проблемы, на которые стоит обратить внимание, если это возможно:

3) Работа, описанная в этой рукописи, основана на привлечении ParA-ATPgS к ДНК, что очевидно неэффективно по сравнению с ParA-ATP (Vecchiarelli, 2013?). Этот факт (если это действительно так) необходимо более четко указать в тексте, в настоящее время он подразумевается лишь косвенно. Есть ли способ проверить выбранные результаты в более физиологических условиях с использованием АТФ (например, с мутантами активного сайта ParA)?

ParA-ATPgS действительно нарушен при превращении димера, не связывающего ДНК, в димер, связывающий ДНК (Vecchiarelli 2010, 2013), и мы использовали это свойство в наших интересах в этом исследовании, чтобы гарантировать, что белки, связанные с нсДНК, представляют собой белки, образующие комплекс.Мы добавили пояснения по этому поводу в исправленную рукопись (стр. 7, строки 133–136).

Однако разница в свойстве связывания нсДНК ParA-ATPgS и ParA-ATP кажется незначительной. Например, при более высоких концентрациях ParA ParA-ATPgS связывает ДНК более эффективно без ParB. Возможно, был обнаружен какой-нибудь мутант активного сайта АТФазы, который позволил бы нам проводить эксперименты в присутствии АТФ. Однако на сегодняшний день мы не нашли мутанта, который делает связывание ДНК зависимым от ParB в присутствии АТФ.Использование мутанта ParA, который связывает нсДНК в присутствии АТФ без ParB, потребует нового экспериментального протокола, который еще предстоит установить. Таким образом, мы будем ждать следующего этапа проекта, чтобы изучить возможное использование АТФаза-дефектного ParA в характеристике комплекса ParA-ParB.

4) Интересны результаты экспериментов по конденсации ДНК ParB. Могли ли авторы оценить / определить (локальную) концентрацию ParB, необходимую для уплотнения ДНК? Сходным образом было бы полезно исследовать, действительно ли происходит прогрессирующая конденсация ДНК путем последовательного рекрутирования димеров ParB на сайт parS (Рисунок 6A).Остановится ли уплотнение ДНК при блокировании parS?

Спасибо за указание на это важное ограничение в нашем текущем эксперименте. В этом исследовании магнитный пинцет не был оснащен функцией флуоресцентной визуализации, поэтому мы не смогли количественно оценить распространение ParB F ​​ вокруг участка parS F ​​ во время конденсации ДНК. Следовательно, мы не можем напрямую оценить количество молекул ParB F ​​, участвующих в конденсации ДНК.Однако в соответствии с недавно опубликованными данными других групп, касающихся хромосомных ParB, мы полагаем, что наши результаты согласуются с представлением о том, что плотно конденсированное состояние ДНК, содержащей parS F ​​ , в наших экспериментах содержит большое количество ParB . Молекулы F . Наши результаты, а также опубликованные работы других групп предсказывают, что блокирование parS остановит уплотнение ДНК. Однако это не было проверено напрямую. В исправленную рукопись мы добавили заявление, разъясняющее эти моменты в Обсуждении на странице 23, строки 448-452.В настоящее время мы готовим экспериментальный план для следующего этапа нашего исследования, чтобы ответить на ряд оставшихся без ответа вопросов, включая вопросы, поднятые здесь рецензентами.

5) На основании экспериментов с магнитным пинцетом (МП) Taylor et al. предположил, что «Наши результаты показывают, что ДНК-конденсация вызывается взаимодействиями ParBF-ParBF, образующими петлевые мосты ДНК, не требуя других белковых факторов». До открытия CTP преобладала точка зрения на то, что ParB-ParB образует опосредованные белком мостики, которые конденсируют ДНК.Теперь, когда мы знаем, что ParB, скорее всего, образует скользящий зажим на ДНК, существует вероятность того, что скольжение вызывает сверхспирализацию ДНК, сродни тому, как RNAP / PNCA работает на ДНК, и что суперспирализация ДНК вызывает уменьшение удлинения ДНК в эксперименте с МТ. Может Тейлор и др. различать две возможности? Может быть, повторить эксперименты МТ с разорванной ДНК, чтобы рассеять накопившуюся суперспирализацию?

Рецензент предлагает интересный момент, касающийся возможности уплотнения, частично вызванного сверхспирализацией ДНК.Чтобы обратиться к этой интересной возможности, мы включили сравнение уплотнения разорванной ДНК и суперспиральной ДНК с помощью ParB. Мы могли отличить разорванную ДНК от «спиральной» (скрученной во вращении) ДНК, скручивая отдельные молекулы ДНК в магнитном пинцете до связывания ParB F ​​. Скручивание интактной спиральной ДНК приводит к образованию плектонем, о чем свидетельствует уменьшение удлинения ДНК, тогда как удлинение разорванной или скрученной ДНК нечувствительно к скручиванию.Мы обнаружили, что конденсация с помощью ParB была сравнима как для молекул ДНК с ограниченным вращением, так и для неограниченных молекул, предполагая, что конденсация ДНК с помощью ParB маловероятна из-за «эффективной генерации суперспирали с помощью ParB, движущегося вдоль ДНК». В отредактированной рукописи мы добавили этот результат как рисунок 6 — приложение к рисунку 2 и добавили текст, объясняющий это, на стр. 19, строки 355-358.

6) Связывает ли ParBF CDP в присутствии / отсутствии parSF? Эксперименты в этой рукописи предполагают, что это так (Рисунок 5F, Рисунок 6B-C), но другие хромосомные ParBs, как известно, не связываются с CDP.

Наши более ранние результаты показали, что CDP (2 мМ), вероятно, связывает ParB F ​​ в условиях нашей реакции. Однако отличие от результатов экспериментов без С-нуклеотидов было относительно незначительным. В ответ на комментарий рецензента мы попытались изучить связывание CDP с ParB F ​​ с помощью биофизических методов, а также попытались измерить кажущееся K i CDP на предмет активности CTPase. Однако мы столкнулись с техническими трудностями, которые, как мы в конечном итоге определили, возникли из-за того, что использованный нами препарат CDP был загрязнен небольшим, но значительным количеством (~ 2-3%) соединения, которое действует как субстрат для ParB F ​​, высвобождение Pi (скорее всего, это ОСАГО, но мы еще не определили напрямую личность загрязнения).Мы исследовали несколько партий CDP, полученных из нескольких источников, но не смогли идентифицировать препарат CDP, свободный от этого загрязнения. Нам не удалось найти коммерческий источник CDP более высокого качества, и очистка CDP в текущих лабораторных условиях приведет к дальнейшим существенным задержкам. Вдобавок, даже если нам удастся получить CDP, по существу, свободный от этого загрязнителя, некоторые из описанных в статье экспериментов с CDP в настоящее время невозможно своевременно повторить; первый автор, проводивший эти эксперименты, был вынужден покинуть страну в прошлом году и не сможет вернуться, чтобы повторить эксперименты, а прибор, использованный для исследования, в настоящее время подвергается реконфигурации для устранения неисправности системы лазерного освещения.

К счастью, в данной статье эксперименты с CDP были выполнены в основном как контрольные эксперименты для сравнения с результатами экспериментов с CTP, и влияние относительно низкой концентрации загрязнителя, если таковое имеется, представляется относительно незначительным. Другими словами, результаты экспериментов с CDP явно отличались от результатов в присутствии CTP, но не сильно отличались от результатов без C-нуклеотидов, что указывает на то, что либо CDP не связывает в значительной степени ParB F ​​ в используемых условиях, либо в случае связывания это, вероятно, не существенно изменяет поведение ParB F ​​ в отношении свойств, исследованных в большинстве экспериментов.Таким образом, вышеуказанный вывод не оказал существенного влияния на общие выводы данной статьи. Мы описали это открытие на стр. 16, строки 305–312 (и рис. 5 — дополнение к рисунку 2D). Во избежание путаницы мы также исключили небольшую часть данных (Рисунок 5B, Рисунок 5F — данные CDP в исходной рукописи), интерпретация которых неоднозначна в свете этого открытия. Мы отредактировали рукопись в ряде дополнительных мест, чтобы отразить это новое открытие, например, стр. 19, строки 362–364.

Мы отмечаем, что Osorio-Valeriano et al., Показали, что ParB MX связывает CDP с низким сродством, но в их измерениях также использовался CDP, поставляемый Sigma с тем же номером по каталогу, который использовался в наших экспериментах, который, как было обнаружено, содержит загрязняющее вещество. . Следовательно, опубликованный K D для CDP может быть неточным.

Мы благодарим рецензентов за комментарий, который побудил нас изучить взаимодействие CDP-ParB и позволил найти проблему, о которой мы не знали.Мы планируем очистку нуклеотидов, когда нам станет доступно необходимое оборудование.

7) Другой интересной областью является то, как на активность ParBF CTPase влияет присутствие ParA, и это само по себе имеет важные последствия для модели «диффузионно-трещотка». Тейлор и др. возможно, захочется исследовать это в будущем, но, может быть, авторы могут упомянуть об этом в Обсуждении?

Как упоминалось в ответе на основной комментарий 1), мы очень заинтересованы в расширении нашего исследования, чтобы ответить на вопросы, предложенные здесь.В идеале было бы неплохо провести чувствительный и нуклеотид-специфический анализ CTPase в присутствии активности ATPase в реакции. Если это окажется трудным, мы можем начать исследование в условиях, когда гидролиз АТФ не происходит, с использованием ATPgS или мутантного ParA.

Для текущей рукописи, как было предложено, мы упомянули этот момент в Обсуждении как один из нескольких оставшихся вопросов, которые должны быть рассмотрены в будущем исследовании на стр. 27, строки 544-545.

https: // doi.org / 10.7554 / eLife.65651.sa2

Разделка

ОБЗОР БИОЛОГИИ

Из-за их функциональной полярности и удлиненной морфологии, основанный на микротрубочках транспорт белков и органелл имеет решающее значение для нормальной функции нейронов. Протеасома необходима во всем нейроне для строго регулируемой деградации широкого набора белковых мишеней, функции которых лежат в основе ключевых физиологических реакций, включая синаптическую пластичность и дегенерацию аксонов.Молекулярно взаимосвязь между транспортом протеасом и транспортом мишеней протеасом неясна. Моторный комплекс динеин необходим для основанной на микротрубочках подвижности многочисленных белков и органелл в нейронах. Это исследование демонстрирует, что транспорт протеасом в нейроне с помощью микротрубочек использует особую легкую цепь динеина по сравнению с синаптическими белками. Живое изображение протеасом и белков синаптических везикул в аксонах и синапсах обнаруживает, что эти грузы перемещаются независимо и что протеасомы демонстрируют значительно сниженные скорости ретроградного транспорта по сравнению с белками синаптических везикул.Генетический и биохимический анализ показывает, что гомолог LC8 легкой цепи динеина, разрезанный на динеин, у дрозофилы связывает протеасомы и функционирует специфически во время их транспортировки. Эти данные подтверждают модель, согласно которой функция Cut-up определяет опосредованный динеином транспорт нейрональных протеасом (Kreko-Pierce, 2017).

Протеасомы представляют собой большие белковые комплексы, ответственные за деградацию нормальных короткоживущих убиквитилированных белков, а также мутантных, неправильно свернутых или поврежденных белков.Все клетки нуждаются в регулируемой деградации белка; однако нервные клетки представляют особый интерес из-за их сложной компартментализации и необходимости деградации белков для нормальной функции нейронов. Кроме того, большое количество неврологических расстройств характеризуется скоплением белковых агрегатов, что позволяет предположить, что нарушение деградации белка является важной этиологией многих нейродегенеративных заболеваний. Поскольку деградация белка в нейронах происходит в короткие сроки и в высокой степени специфична для компартментов, нейроны должны обладать молекулярными механизмами, которые могут точно позиционировать протеасомы вблизи того места, где они однозначно необходимы, а также поддерживать физическое разделение между протеасомами и нейронными мишенями для сохранения эффективности регулируемых белковый оборот (Kreko-Pierce, 2017).

Многочисленные исследования продемонстрировали важную физиологическую потребность протеасомной активности во многих компартментах нейрона. Пресинаптическая протеасомно-зависимая деградация белка имеет решающее значение для образования синапсов, синаптической эффективности и высвобождения нейротрансмиттеров. Постсинаптически протеасомы участвуют в регуляции нескольких форм синаптической пластичности, включая долгосрочную потенциацию (LTP), долгосрочное облегчение (LTF) и долгосрочную депрессию (LTD).Более того, острая деполяризация нейронов вызывает глобальное изменение убиквитилированных белков активной зоны в синапсе, поддерживая роль протеасом в быстром обороте белков в ответ на активность нейронов. В совокупности эти данные предполагают, что протеасомы функционируют локально в пре- и постсинаптических сайтах, где они действуют как важные модуляторы синаптической структуры, функции и пластичности (Kreko-Pierce, 2017).

Помимо синаптических компартментов, есть доказательства того, что функция протеасом также играет важную роль в росте, развитии и регенерации аксонов.Недавняя работа по развитию нейронов показала, что изменения в ретроградном аксональном транспорте протеасом являются критическими во время спецификации и роста аксона. Исследования на Drosophila предоставляют доказательства того, что дегенерация аксонов, которая происходит во время обрезки в процессе развития или в ответ на травму, требует убиквитин-протеасомной системы (UPS). В соответствии с этими наблюдениями на мухах, ингибирование UPS на моделях грызунов задерживает отмирание аксонов, наблюдаемое во время дегенерации аксонов Валлера, демонстрируя роль деградации белка во время запрограммированной дегенерации аксонов у млекопитающих.Эти данные предоставляют убедительные доказательства эволюционно законсервированной потребности в активности протеасом в аксоне как в нормальных, так и в патологических условиях (Kreko-Pierce, 2017).

Несмотря на критические компартмент-специфические требования для функции протеасом в нейронах, мало что известно о молекулярных механизмах, которые управляют транспортом протеасом и их мишенями в нейронах. Транспортировка органелл и транспортных везикул во всех клетках преимущественно опосредуется транспортными механизмами на основе микротрубочек (МТ) с использованием двух различных молекулярных моторных белков, кинезинов и цитоплазматических динеинов.Кинезины в основном опосредуют транспорт, направленный на плюс-конец MT, включая антероградный транспорт аксонов в нейронах. В геноме человека 45 генов кодируют суперсемейство кинезинов, поддерживая генетическую основу большого разнообразия транспортных событий, связанных с грузом, на основе кинезина. Цитоплазматический динеин опосредует транспорт MT, направленный на минус-конец, включая ретроградный транспорт аксонов. Однако, в отличие от кинезинового мотора, цитоплазматический динеин кодируется относительно небольшим количеством генов, что позволяет предположить, что груз-специфичность моторного комплекса динеина достигается за счет гетерогенности субъединиц динеинового комплекса и различных связанных с динеином дополнительных белков.Легкие цепи динеина LC8 (DYNLL1 и DYNLL2 у млекопитающих) были предложены в качестве карго-адаптеров, потенциально обеспечивающих специфичность для направленного на минус-конец транспорта везикул и органелл MT. Это мнение было подтверждено исследованиями, в которых было обнаружено, что LC8 одновременно ассоциируется с динеиновым мотором и с рядом грузов, которые подвергаются МТ-опосредованному транспорту (Kreko-Pierce, 2017).

В этом исследовании использовалось сочетание генетики, биохимии и визуализации in vivo для сравнения основанного на МТ транспорта протеасом и синаптических белков в двигательных нейронах дрозофилы.Эти анализы показали, что протеасомы используют транспорт аксонов на основе MT в аксонах и что транспорт аксонов качественно подобен транспорту синаптических белков. Однако количественный анализ транспорта протеасом выявляет значительные различия в ретроградном транспорте протеасом по сравнению с транспортом синаптических белков. Эти данные указывают на потенциальные молекулярные различия в моторных комплексах динеина, используемых этими двумя разными типами грузов. В поддержку этой идеи прямой генетический скрининг идентифицировал ген cut up (ctp) , гомолог LC8 у дрозофилы, как необходимый для аксонального транспорта протеасом, но не синаптических белков.Эти результаты предоставляют молекулярные доказательства того, что протеасомы и их мишени используют специфические моторные компоненты динеина во время транспорта на основе МТ в нейронах (Kreko-Pierce, 2017).

Это исследование использовало покадровую визуализацию флуоресценции и отслеживание отдельных частиц в личинках дрозофилы третьего возраста для изучения движения протеасом в двигательных нейронах. Данные демонстрируют, что протеасомы используют быстрый транспорт аксонов на основе MT для движения в двигательных нейронах дрозофилы, в том числе в пресинаптическом нервном окончании.Количественный анализ протеасомного транспорта в аксонах мотонейронов показал, что скорость ретроградного транспорта протеасом значительно ниже скорости антероградного транспорта. Это похоже на то, что наблюдалось при разработке культур гиппокампа, полученных из мозга мышей, что подтверждает идею консервативных транспортных механизмов. Кроме того, было обнаружено, что значения ретроградной скорости и длины пробега протеасом значительно меньше, чем у белков синаптических везикул, и что мутации в гене Klc оказали гораздо более сильное влияние на скорости ретроградного транспорта синаптобревина, чем на протеасомы. .Наконец, генетический анализ протеасомного транспорта показал, что у дрозофилы гомолог легкой цепи динеина LC8 млекопитающих, cut up (ctp) , необходим для ретроградного аксонального транспорта протеасом, но незаменим для ретроградного аксонального транспорта белков синаптических везикул. Эти анализы убедительно подтверждают модель, согласно которой протеасомы используют моторный комплекс динеина для транспорта, отличный от того, который используется другими синаптическими грузами. Интересно отметить, что синаптотагмин был идентифицирован как в протеомных исследованиях протеасомозависимой деградации белка, так и обнаружен в polyQ-индуцированных агрегатах белка.Эти данные подтверждают идею о том, что синаптотагмин, вероятно, расщепляется протеасомой, возможно, в синапсе. Учитывая физиологическое значение изменений в количестве ключевых синаптических молекул, таких как синаптотагмин, возможно, неудивительно, что протеасома и ее синаптические мишени используют разные транспортные механизмы. Можно было бы предсказать, что такое расположение будет защищать от непреднамеренных взаимодействий между ключевыми субстратами и протеасомами, сохраняя физиологическую эффективность регулируемых изменений в содержании белка (Kreko-Pierce, 2017).

Модель, согласно которой протеасомы и синаптические белки передаются независимо, по-видимому, противоречит данным недавнего исследования аксонального транспорта протеасом из культивируемых нейронов гиппокампа, которые предполагают, что протеасомы совместно транспортируются с различными мембранно-связанными грузами, включая синаптические пузырьки. белок синаптофизин. Это исследование специально рассматривало эту возможность путем одновременной коэкспрессии протеасом и синаптобревина в одном двигательном нейроне и анализа транспорта.Эти анализы совместного транспорта показали, что только 8% транспортных везикул синаптобревина совместно транспортируются с протеасомами, несмотря на сравнительно большое количество протеасомных частиц. Также было обнаружено, что в настоящем исследовании большая часть протеасом (~ 65%) движется, тогда как в другом исследовании сообщается об относительно небольшой популяции мобильных протеасом (~ 20%), причем большинство частиц демонстрируют беспорядочное обратное движение. (~ 80%). Более того, скорости ретроградного и антероградного транспорта протеасом, о которых сообщалось ранее, намного ниже, чем то, что наблюдалось в текущем исследовании.Следует отметить, что скорости, которые сообщаются как для антероградного, так и для ретроградного транспорта протеасом, согласуются со скоростями протеасом, наблюдаемыми в культивируемых нейронах гиппокампа во время дифференцировки аксонов. Эти несоответствия между исследованиями могут отражать различия, связанные с разными типами нейронных клеток или экспрессией репортера, или различиями между моделью in situ и культивированными первичными нейронами (Kreko-Pierce, 2017).

Цитоплазматический динеин — это мультисубъединичный моторный белок, ответственный за транспорт широкого диапазона грузов на основе МТ.Текущие данные предполагают, что Ctp Drosophila DLC может определять аксональный транспорт отдельных грузов. В соответствии с этой ролью, семейство DLCs LC8 (DYNLL1 и DYNLL2) млекопитающих, как было показано, одновременно связано с мотором динеина и рядом грузовых белков, включая компоненты активной зоны и белки, участвующие в локализации мРНК во время эмбриогенеза. Важно отметить, что мутации, которые нарушают взаимодействие этих белков с LC8, как было показано, нарушают их динеин-опосредованный транспорт MT, обеспечивая связь между LC8-связывающими партнерами и MT-зависимым переносом.Помимо демонстрации того, что ctp был необходим для нормального аксонального транспорта протеасом, представлены биохимические доказательства того, что Ctp физически взаимодействует с 20S и 19S субъединицами протеасом. Из этих исследований коиммунопреципитации неясно, связывается ли Ctp напрямую с этими специфическими субъединицами или, возможно, с какой-то другой субъединицей протеасомы. Структурные исследования показали, что большое количество различных грузов связывается с одной и той же бороздой в димере LC8 / Ctp и в некоторых случаях может либо конкурировать, либо способствовать связыванию с другими грузами, включая промежуточную цепь динеина.На основании текущих данных можно было бы предсказать, что связывание протеасомы 26S с Ctp будет способствовать ассоциации Ctp с промежуточной цепью динеина и облегчать динеин-зависимый транспорт. Ни синаптобревин, ни синаптотагмин не обладают такой активностью (Kreko-Pierce, 2017).

Помимо обеспечения специфичности груза, результаты также предполагают, что Ctp может влиять на процессивность динеинового мотора. Во-первых, было замечено, что протеасомы имеют более медленную ретроградную скорость транспорта, чем синаптобревин.Кроме того, ретроградные скорости и длина пробега протеасомного транспорта снижены, но не отсутствуют у мутантов ctp . Эти результаты предполагают, что ассоциация Ctp с мотором динеина изменяет биохимическую функцию результирующего моторного комплекса. В настоящее время мало что известно о том, как DLC участвуют в двигательной активности какой-либо системы. Предыдущие исследования продемонстрировали, что процессивность и активность динеинового мотора могут быть изменены посредством взаимодействий с различными регуляторными белками.Например, было показано, что динактиновый комплекс значительно увеличивает процессивность динеина, аналогично тому, что показано для ctp . Интересно, что несколько недавних исследований показывают, что для нормального взаимодействия между динеином и динактиновым комплексом необходима легкая цепь динеина LC8 (Jie, 2015; Stuchell-Brereton, 2011). Кроме того, мутации, которые нарушают функцию Dyn2 (дрожжевой гомолог LC8), также нарушают рекрутирование динактинового комплекса в моторный комплекс динеина (Stuchell-Brereton et al., 2011). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, изменяет ли Ctp процессивность протеасом из-за рекрутирования динактинового комплекса (Kreko-Pierce, 2017).

Исследования с использованием фармакологического ингибирования активности протеасом показали, что ингибирование протеасом приводит к быстрому увеличению функции синапсов, включая высвобождение нейротрансмиттера, что позволяет предположить, что протеасомы локализуются рядом с местом высвобождения нейротрансмиттера. Несмотря на доказательства, подтверждающие присутствие протеасом в пресинаптическом нервном окончании, прямые доказательства этого отсутствуют.Это исследование является первым, которое визуализирует и изучает перемещение протеасом в пресинаптическом нервном окончании. Более того, согласованность в динамике транспорта между аксоном и синапсом, совместная локализация с Futsch и отсутствие движения у мутантов ctp подтверждают идею о том, что синаптический транспорт протеасомы основан на MT. Более того, анализ морфологии синапсов у мутантов ctp демонстрирует, что протеасомы необходимы внутри NMJ для нормального роста синапсов во время развития личинок.Недавние исследования, направленные на изучение постсинаптических протеасом, подтвердили, что протеасомы претерпевают динамические изменения в своей субклеточной локализации в ответ на деполяризацию, указывая тем самым на роль транспорта протеасом во время синаптической пластичности. Будет важно исследовать, влияют ли мутации ctp на синаптическую пластичность в NMJ Drosophila (Kreko-Pierce, 2017).

Интересно, что это исследование также обнаружило, что поведение протеасом в синапсах имеет некоторые важные отличия от движения аксонов.Между этими двумя нейрональными компартментами наблюдалась существенная разница в количестве стационарных частиц, при этом количество стационарных протеасом в синапсе увеличивалось на ~ 400%. Кроме того, было обнаружено, что синаптические протеасомы перемещаются в среднем медленнее, чем протеасомы в аксонах. Подобное изменение в перемещении между аксоном и нервным окончанием также наблюдалось для белков нейрексина (Nrxn), которые также медленнее транспортируются в синапсе по сравнению с аксоном.Комбинация этих изменений в поведении по трафику способствует более длительному пребыванию отдельной протеасомы в синапсе по сравнению с аксоном. Распределение стационарных протеасом по всему NMJ может способствовать локальной деградации синаптических белков внутри бутона. Такое поведение контрастирует с исследованиями транспорта содержащих нейропептиды плотных ядерных везикул (DCV) внутри NMJ, которые имеют несколько стационарных везикул и используют модель непрерывного транспорта в синапсах, обеспечивающую непрерывный источник DCV.Эти различия указывают на то, что транспорт на основе MT внутри синапса приспособлен к конкретному грузу и их соответствующим функциям (Kreko-Pierce, 2017).

Обратная регуляция двух генов-мишеней классического пути Hippo у Drosophila белком-концентратором димеризации Ctp
Семейство LC8 небольших белков ~ 8 кДа высоко консервативно и взаимодействует с множеством белковых партнеров в эукариотических клетках. Связывание LC8 модулирует активность целевого белка, часто за счет индуцированной димеризации через гомодимеры LC8: LC8.Хотя многие LC8-интеракторы играют роль в сигнальных каскадах, роль LC8 в развитии эпителия плохо изучена. С использованием крыло Drosophila как Модель развития, это исследование показало, что член семейства LC8 Cut up (Ctp) в первую очередь необходим для стимулирования роста эпителия, который коррелирует с воздействием на фактор роста dMyc и два гена, diap1 и bantam , которые являются классическими мишенями коактиватора пути Hippo Yorkie.Генетические тесты подтверждают, что Ctp поддерживает разрастание тканей, вызванное Йорки и указать, что Ctp действует через Yorkie, чтобы контролировать бантам ( запрет ) и diap1 транскрипция. Однако совершенно неожиданно потеря Ctp имеет обратный эффект на запрет и diap1 : поднимает запрет экспрессия, но уменьшает экспрессию diap1 . В обоих случаях эти изменения транскрипции отображаются на небольших сегментах этих промоторов, которые нанять Йорки.Хотя LC8 комплексы с Yap1, гомологом Йорка, в клетки человека, ортологическое взаимодействие не обнаружено в Drosophila клетки. В совокупности эти данные показывают, что Drosophila Ctp является необходимым регулятором генов-мишеней Yorkie in vivo и предполагает, что Ctp может взаимодействовать с белками пути Hippo, оказывая обратные транскрипционные эффекты на гены-мишени Yorkie (Barron, 2016).

Семейство легких цепей цитоплазматического динеина LC8, которое включает LC8 позвоночных (также известное как DYNLL1 / DYNLL2) и Drosophila Cut-up (Ctp), представляет собой небольшие высококонсервативные белки, которые экспрессируются повсеместно и необходимы для жизнеспособности.Белок LC8 имеет размер 8 килодальтон (кДа) и был впервые идентифицирован как вспомогательная субъединица в моторном комплексе динеина, внутри которого гомодимер LC8 связывается и стабилизирует пару промежуточных цепей динеина (DIC). Однако белок LC8 с тех пор превратился в центр общего взаимодействия с множеством динеин / мотор-независимых ролей и партнеров по связыванию. Фактически, большая часть белка LC8 в клетках млекопитающих не связана ни с динеином, ни с микротрубочками, а ортологи LC8 кодируются в геномах цветковых растений, в которых в противном случае отсутствуют гены, кодирующие двигатели динеина тяжелых цепей (Barron, 2016 и ссылки в нем).

Накапливающиеся данные подтверждают идею о том, что основная роль LC8 в клетках млекопитающих заключается в облегчении димеризации его партнеров по связыванию посредством самоассоциации LC8, механизма, который был назван «молекулярной липучкой». LC8 может быть обнаружен в ассоциации с более чем 40 белками, которые функционируют в различных клеточных процессах, включая внутриклеточный транспорт, ядерную транслокацию, развитие клеточного цикла, апоптоз, аутофагию и экспрессию генов. LC8 обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме и может взаимодействовать с партнерами в любом компартменте.Например, киназа млекопитающих Pak1 связывает и фосфорилирует LC8 в цитоплазме, что, в свою очередь, увеличивает способность LC8 взаимодействовать с белком Bim, содержащим только Bh4, и ингибировать его проапоптотическую активность. Соответственно, сверхэкспрессия LC8 или фосфорилирование LC8 с помощью Pak1 увеличивает выживаемость и пролиферацию клеток рака груди в культуре. LC8 также связывает рецептор эстрогена-α (ERα) и способствует ядерной транслокации ERα, которая, в свою очередь, рекрутирует LC8 в хроматин генов-мишеней ERα.В цитоплазме LC8 также обнаруживается в ассоциации с белком, экспрессируемым в почках и головном мозге (KIBRA), который является вышестоящим регулятором пути подавления опухоли Hippo. Связывание KIBRA усиливает действие LC8 на ядерную транслокацию ERα, предполагая, что между путями, регулируемыми LC8, могут возникать перекрестные помехи. Комплекс KIBRA-LC8 также взаимодействует с Sorting Nexin-4 (Snx4), чтобы способствовать управляемому динеином перемещению груза между ранним и рециркулирующим эндосомными компартментами. Таким образом, LC8 был связан с множеством белков как в цитоплазме, так и в ядре, которые играют важную роль в передаче сигналов, динамике мембраны и экспрессии генов (Barron, 2016).

Ctp дрозофилы отличается от LC8 / DYNLL позвоночных только четырьмя консервативными аминокислотными заменами по длине 89 аминокислот. Подобно LC8 у млекопитающих, фенотипы, продуцируемые потерей Ctp у мух, предполагают роль во множестве механизмов развития. Дрозофилы, полностью лишенные Ctp, погибают во время эмбриогенеза из-за чрезмерного и широко распространенного апоптоза. Частичная потеря функции Ctp вызывает истончение щетинок крыльев и морфогенетические дефекты в развитии крыльев, а также дезорганизацию яичников и бесплодие самок.В клетках слюнных желез Ctp способствует аутофагии во время окукливания, тогда как в нейрональных стволовых клетках он локализуется в центросомах и влияет на ориентацию митотического веретена и симметрию клеточного деления. Мутантные семенники по ctp имеют моторно-зависимые дефекты в сперматагониальных делениях, а также моторно-независимые дефекты дифференцировки клеток кисты. Недавнее исследование связывало экспрессию мРНК ctp с фактором транскрипции цинкового пальца dASCIZ и показало, что нокдаун Ctp или dASCIZ уменьшает размер крыла.В общем, это разнообразие эффектов, вызываемых потерей Ctp в разных типах клеток Drosophila, указывает на то, что Ctp играет важную, но контекстно-зависимую роль in vivo. Однако знания о молекулярных путях, которые требуют Ctp и, в свою очередь, лежат в основе этих фенотипов развития, связанных с потерей Ctp, остаются плохо охарактеризованными (Barron, 2016).

В этом исследовании использовался геномный нулевой аллель ctp и валидированный трансген РНКи ctp для оценки роли белков семейства Ctp / LC8 / DYNLL в путях, которые действуют в развивающемся эпителии крыла дрозофилы.Клоны нулевых клеток ctp довольно малы по сравнению с контролями, и истощение РНКи Ctp уменьшает размер соответствующего сегмента взрослого крыла без явных дефектов в митотической прогрессии или формировании паттерна ткани. Влияние истощения Ctp на размер крыла взрослых в первую очередь связано с уменьшением размера клеток, а не с делением клеток или количеством клеток, что подразумевает роль Ctp в поддерживающих механизмах, обеспечивающих рост в процессе развития. При оценке влияния потери Ctp на несколько путей, контролирующих рост крыла, сильные эффекты были обнаружены на одном пути — Hippo.Путь Hippo — это консервативный путь супрессора роста, который действует через свою основную киназу Warts, чтобы ингибировать ядерную транслокацию коактиватора Yorkie (Yki), который в противном случае проникает в ядро, образует комплекс с ДНК-связывающим фактором Scalloped (Sd) и активирует транскрипцию гены роста и выживания. Параллельно влиянию потери Ctp на размер клона и крыла, потеря Ctp изменяет экспрессию классических генов-мишеней Yki bantam и thread (th) / diap-1 в клетках мешочка крыльев.Параллельные генетические тесты подтверждают потребность в ctp в Yki-управляемом росте ткани в крыле или глазу. Однако совершенно неожиданно потеря Ctp оказывает противоположное влияние на транскрипцию bantam и diap1 в клетках крылового мешка: транскрипция bantam сильно повышена, в то время как экспрессия diap1 сильно снижена в клетках, лишенных Ctp. В каждом случае эти эффекты отображаются на небольшие сегменты ДНК в промоторах ban и diap1 , которые рекрутируют транскрипционные комплексы Yki.Эксперименты с эпистазом подтверждают, что Yki необходим для активации промотора bantam в Ctp-истощенных клетках, и что трансгенная экспрессия Yki может преодолевать блокировку транскрипции diap1 . В сумме эти данные утверждают, что Ctp поддерживает физиологическую передачу сигналов Hippo в эпителиальных клетках крыльевых дисков и что Ctp, вероятно, взаимодействует с еще не идентифицированными белками пути Hippo, чтобы оказывать обратные транскрипционные эффекты на гены-мишени Yorkie. Эти типы обратных эффектов ранее не были описаны в рамках пути Hippo и подразумевают, что отдельные подмножества генов в транскриптоме Yorkie могут одновременно активироваться и подавляться в развивающихся тканях с помощью механизма, включающего Ctp (Barron, 2016).

Digitor / dASCIZ выполняет несколько ролей в развитии дрозофилы

Это исследование предоставляет доказательства того, что белок матрикса веретена Skeletor в Drosophila взаимодействует с человеческим ортологом ASCIZ (также известным как ATMIN и ZNF822), Digitor. Это взаимодействие было впервые обнаружено на дрожжевом двугибридном скрининге и впоследствии подтверждено анализом с понижающим давлением. Исследование также подтверждает ранее задокументированная функция Digitor в качестве регулятора экспрессии легкой цепи динеина / Cut up.Digitor, как было показано, является ядерным белком, который локализуется в межпозвоночных и онтогенетических областях хромосом во время интерфазы, но перераспределяется в область веретена во время митоза. Его митотический локализация и физическое взаимодействие со Skeletor предполагает возможность того, что Digitor играет прямую роль в митотической прогрессии в составе шпиндельного матричного комплекса. Кроме того, истинный нулевой аллель Digitor приводит к полной гибели куколок при гомозиготности, что указывает на то, что Digitor является важным геном.Дигитор играет решающую роль в регуляции метаморфоза и органогенез, а также ответ на повреждение ДНК. В Digitor У нуль-мутантных личинок уровень γh3Av значительно повышен, что указывает на накопление двунитевых разрывов ДНК. Кроме того, снижение уровня Digitor снижает устойчивость к окислительной реакции, вызванной паракватом. стресс, приводящий к увеличению смертности в парадигме стресс-теста. Это было показали, что раннее последствие развития из-за отсутствия Дигитор имеет уменьшенный размер мозга личинок третьего возраста, хотя в целом В остальном развитие личинок на этой стадии кажется нормальным.В целом данные показывают что Digitor является ядерным белком, который выполняет несколько ролей в Drosophila развитие личинок и куколок (Sengupta, 2016).

Это исследование представляет доказательства того, что у Drosophila матричный белок веретена Skeletor взаимодействует с Digitor / dASCIZ, ортологом ASCIZ человека. Это взаимодействие было обнаружено на дрожжевом двугибридном скрининге и подтверждено анализом «pull-down». Трансгенная экспрессия конструкции Digitor, меченной mCitrine, показывает, что белок Digitor / dASCIZ локализован в межблочных и онтогенетических областях хромосомы во время интерфазы, но что он перераспределяется во время митоза в область веретена.Анализ RT-PCR идентифицировал и охарактеризовал аллель вставки P-элемента Digitor / dASCIZ, который, по-видимому, является истинным нулевым аллелем. При гомозиготности этот аллель приводит к полному летальному фенотипу куколки, указывая на то, что Digitor / dASCIZ является важным геном. Летальность куколки была частично снижена (жизнеспособность 31%) трансгенной экспрессией 3xHA-Digitor-mCitrine на гомозиготном мутантном фоне Digitor / dASCIZ. Спасение не было полным, вероятно, из-за различий в уровнях экспрессии трансгена по сравнению с экспрессией гена дикого типа.Наш анализ фенотипических последствий отсутствия Digitor / dASCIZ во время развития в сочетании с его динамической ядерной локализацией предполагает, что Digitor / dASCIZ выполняет множественные роли в развитии Drosophila (Sengupta, 2016).

Ранее Зайцева (2014), используя RNAi-нокдаун Digitor / dASCIZ в заднем отделе дисков имагинальных крыльев, предоставила доказательства того, что уменьшение Digitor / dASCIZ приводит к нарушению митоза с серьезными дефектами выравнивания веретена и хромосом, а также к уменьшению размера крыла. .Эти эффекты в основном приписывались снижению экспрессии легкой цепи динеина ( Cut up ), когда уровни Digitor / dASCIZ снижены. Однако это исследование показало, что Digitor / dASCIZ, помимо связывания с самим Cut up, имеет прямое физическое связывание с белком матрикса веретена Skeletor. Было продемонстрировано, что Drosophila веретенообразный матричный белок Megator гомолог Tpr в клетках млекопитающих ассоциирует с Dynein комплексом во время митоза. Кроме того, анализ живых изображений показал, что Digitor / dASCIZ ограничен областью веретена во время митоза во время после NEB, когда нет диффузионных барьеров.Таким образом, эти результаты предполагают возможность того, что Digitor / dASCIZ может играть прямую роль в митотической прогрессии как член веретенообразного матрикса и / или динеинового комплекса в дополнение к тому, что он служит транскрипционным регулятором экспрессии легкой цепи динеина (Sengupta, 2016). .

Обогащение и локализация Digitor / dASCIZ в областях развития puff предполагают роль в созревании и метаморфозе органов. Более того, динамическое перемещение Digitor / dASCIZ из областей развития puff во время условий теплового шока совместимо с гипотезой о том, что Digitor / dASCIZ может модулировать экспрессию генов в этих сайтах и ​​что эта модуляция изменяется во время стрессовой реакции.Ранним фенотипом, наблюдаемым у мутантных личинок Digitor , ползающих на третьем возрастном этапе, был сильно уменьшенный размер мозга, хотя общее развитие личинок на этой стадии выглядело нормальным с размером и массой мутантных личинок, неотличимых от личинок дикого типа. В то время как было обнаружено лишь небольшое увеличение гибели клеток и апоптоза в мозге мутанта Digitor , наблюдалось заметное уменьшение количества активно делящихся клеток в пролиферирующих зонах мозга, что указывает на то, что нарушение пролиферации клеток было основной причиной мутантного фенотипа малого мозга.Это контрастирует с выводами Zaytseva (2014), показывающими, что основной причиной уменьшения размера крыла после нокаута Digitor / dASCIZ RNAi была остановка анафазы митотических клеток, вызванная зависимыми от комплекса Dynein дефектами веретена, ведущими к усиленному апоптозу. Однако, учитывая плейотропные эффекты Digitor / dASCIZ , последствия его отсутствия, вероятно, зависят от ткани и контекста. Например, это исследование предоставляет доказательства того, что фактическая запрограммированная гибель клеток личиночной слюнной железы во время окукливания не происходит в отсутствие Digitor / dASCIZ Digitor null начинается окукливание мутанта ; однако эклозии не происходит, а развитие куколки нарушается и останавливается на разных стадиях. ОТ-ПЦР-анализ уровней транскриптов генов, регулируемых экдизоном, контролирующих метаморфоз и последующую эклозию в сигнальном каскаде экдизона, показал значительное снижение некоторых, но не всех исследованных генов. Поэтому предполагается, что фенотип куколки у мутанта Digitor является результатом изменений в экспрессии подмножества генов, регулируемых экдизоном, а также Mdh3 , и что Digitor / dASCIZ играет роль в метаморфозе, действуя как регулятор транскрипции этих генов.Однако следует отметить, что эксперименты не исключают, что эти эффекты являются косвенным следствием временных нарушений и / или нарушения регуляции. У млекопитающих ASCIZ также выполняет несколько независимых от ATM-киназ функций развития и необходим для созревания В-клеток, а также для органогенеза легких, почек и мозга. Некоторые из этих дефектов являются следствием понижающей регуляции легкой цепи динеина; однако в других случаях предполагается, что эффекты вызываются модуляцией онтогенетических сигнальных каскадов, таких как путь Wnt (Sengupta, 2016).

ASCIZ млекопитающих играет роль в организации АТМ-киназы, но не в NBS1-зависимой репарации повреждений ДНК в ответ на агенты, которые нарушают структуру хроматина, такие как хлорохин, или за счет осмотического и окислительного стресса. Это исследование предоставляет прямые доказательства эволюционно консервативной роли Digitor / dASCIZ в ответе на повреждение ДНК у Drosophila . У нуль-мутантных личинок Digitor уровни γh3Av были значительно повышены, что указывает на накопление DSB в отсутствие Digitor / dASCIZ.Кроме того, сниженные уровни Digitor / dASCIZ снижали устойчивость к окислительному стрессу, вызванному паракватом, что приводило к увеличению смертности в парадигме стресс-теста. Более того, Зайцева показала, что GFP-tagged Digitor / dASCIZ, экспрессируемый в клетках HeLa, накапливается в течение 5 минут вдоль треков индуцированного лазером окислительного повреждения ДНК, напоминающего ассоциацию ASCIZ человека с очагами, вызванными окислительным повреждением ДНК (Sengupta, 2016).

Таким образом, это исследование показывает, что Digitor / dASCIZ выполняет несколько онтогенетических функций у Drosophila и играет критическую роль в регуляции метаморфоза и органогенеза, а также в ответе на повреждение ДНК.Кроме того, предоставлены доказательства того, что Digitor / dASCIZ может вносить вклад в митотическую прогрессию не только в качестве регулятора транскрипции легкой цепи динеина, но также посредством прямого физического взаимодействия с матрицей веретена (например, Skeletor). Это будет представлять интерес в будущих исследованиях для дальнейшего выяснения многих функциональных ролей Digitor / dASCIZ и их взаимодействия в очень удобной модельной системе Drosophila (Sengupta, 2016).

Новый белок цинкового пальца dASCIZ регулирует митоз у Drosophila через важную роль в экспрессии легкой цепи динеина

Незаменимый белок цинкового пальца ASCIZ (также известный как ATMIN, ZNF822) играет важную роль в органогенезе легких и развитии В-клеток у мышей, где он регулирует экспрессию легкой цепи динеина (DYNLL1 / LC8), но его функции у других видов в том числе беспозвоночные, в значительной степени неизвестны.В этом исследовании сообщается об идентификации ортолога ASCIZ у дрозофилы (dASCIZ) и показано, что потеря функции dASCIZ приводит к выраженным задержкам митоза с дефектами позиционирования центросом и веретена во время развития, что напоминает нарушение моторных функций динеина. Интересно, что сходные митотические дефекты и дефекты развития наблюдались после нокдауна DYNLL / LC8-type dynein light chain Cutup (Ctp), и фенотипы потери функции dASCIZ могли подавляться эктопической экспрессией Ctp.В соответствии с генетической функцией dASCIZ перед Ctp, было показано, что потеря dASCIZ приводит к снижению эндогенных уровней мРНК и белка Ctp и резко снижает активность репортерного гена Ctp-LacZ in vivo, что указывает на то, что dASCIZ регулирует развитие и митоз как транскрипцию Ctp. фактор. Предполагается, что более серьезные митотические дефекты в отсутствие ASCIZ у мух по сравнению с мышами могут быть связаны с избыточностью второго, ASCIZ-независимого гена Dynll2 у млекопитающих в отличие от одного гена Ctp у Drosophila.В совокупности эти данные демонстрируют, что ASCIZ является эволюционным высококонсервативным транскрипционным регулятором уровней легкой цепи динеина и новым регулятором митоза у мух (Зайцева, 2014).

Субстрат ATM Chk2-взаимодействующий Zn 2+ finger (ZnF) белок (ASCIZ; также известный как ATMIN, ZNF822) был идентифицирован как белок, который формирует очаги, вызванные повреждением ядерной ДНК, специфически в ответ на алкилирующие или окисляющие агенты ДНК. , а отсутствие ASCIZ увеличивает чувствительность к этим базовым повреждениям.ASCIZ содержит четыре N-концевых ZnF и C-концевой SQ / TQ-кластерный домен (SCD), обогащенный сайтами фосфорилирования для ATM-подобных киназ ответа на повреждение ДНК. Однако SCD ​​также функционирует как мощный домен активации транскрипции, и мышиные модели с дефицитом Asciz выявили основные независимые от повреждений ДНК функции развития в качестве фактора транскрипции. Нокаут Asciz по зародышевой линии приводит к поздней эмбриональной летальности с рядом аномалий развития, включая тяжелые дефекты отделения передней кишки с полным отсутствием легких.МРНК легкой цепи динеина DYNLL1 была наиболее сильно подавленным транскриптом (~ 10 раз) в нокаутных клетках мыши Asciz , и аналогичные сокращения DYNLL1 наблюдались в ASCIZ-дефицитных клетках человека и курицы. ASCIZ связывается с промотором Dynll1 в первичных клетках мыши и активирует его транскрипцию ZnF-зависимым образом, что согласуется с функцией фактора транскрипции ZnF (Зайцева, 2014).

DYNLL1 (LC8) был впервые идентифицирован как легкая цепь моторного комплекса динеина, где он может способствовать ассоциации промежуточных цепей динеина с тяжелыми цепями, но с тех пор превратился в регулятор, возможно, более чем 100 различных белков (King , 2008; Барбар 2008; Рапали, 2011б).DYNLL1 структурно высоко консервативен на протяжении всей эволюции; например, человеческий DYNLL1 и его ортолог Drosophila Cutup (Ctp) отличаются всего четырьмя консервативными заменами в 89-аминокислотных белках (Dick, 1996; Phillis, 1996). В то время как нулевые мутации Ctp являются летальными для Drosophila , и даже гипоморфные мутации приводят к серьезным дефектам морфогенеза (Dick, 1996; Phillis, 1996; Batlevi, 2010), о мутациях потери функции Dynll1 не сообщалось. у позвоночных, и остается неясным, является ли его регуляция столь же консервативной, как его структура и функции (Зайцева, 2014).

Интересно, что помимо действия в качестве активатора транскрипции экспрессии гена Dynll1 , сам ASCIZ также является основным связывающим DYNLL1 белком. ASCIZ SCD содержит 11 мотивов TQT, 10 из которых являются функциональными сайтами связывания DYNLL1 (Rapali, 2011a; Jurado, 2012a). Важно отметить, что связывание DYNLL1 с этими сайтами подавляет транскрипционную активность ASCIZ зависимым от концентрации образом, и двойная способность ASCIZ активировать промотор Dynll1 и «ощущать» концентрацию продукта своего гена, следовательно, создает петлю обратной связи для поддержания стабильные уровни свободного белка DYNLL1 (Jurado, 2012a).Степень, в которой нарушенная регуляция DYNLL1 способствует дефектам органогенеза у мышей Asciz KO, еще предстоит определить, но серьезные дефекты развития В-клеток у условных делетеров Asciz могут быть устранены за счет эктопической экспрессии Dynll1 , демонстрируя, что этот фенотип обусловлен на восстановленный DYNLL1 (Jurado, 2012b; Зайцева, 2014 и ссылки в нем).

В то время как его транскрипционные функции в качестве регулятора Dynll1 и его функции ответа на повреждение оснований ДНК, по-видимому, сохраняются от птиц к человеку, ортологи ASCIZ ранее не были идентифицированы у беспозвоночных.Это исследование сообщает об идентификации открытой рамки считывания CG14962 у мух как ортолога Drosophila melanogaster ASCIZ (dASCIZ) и предоставляет первое доказательство того, что ASCIZ необходим для развития у Drosophila . Поразительно, хотя Drosophila ASCIZ является консервативным транскрипционным регулятором экспрессии Dynll1 / Ctp , это исследование показывает, что его отсутствие приводит к серьезным митотическим дефектам, выходящим за рамки более ограниченного и относительно специфичного органогенеза и дефектов В-лимфопоэза в ASCIZ KO. мышей, вероятно, в результате снижения избыточности DYNLL у мух (Зайцева, 2014).

Дефекты митотического и клеточного выживания, наблюдаемые в этом исследовании для dASCIZ и нокдаунов Ctp RNAi, согласуются с предыдущими сообщениями, связывающими Ctp с ролями в выживании эмбриональных клеток и апоптозе в процессе развития. Хотя это исследование анализировало только дефекты, возникающие в результате потери этих двух белков в развивающемся крыле, предполагается, что нокдаун dASCIZ также имитирует фенотипы потери функции Ctp в других тканях.Митотический блок / задержка с накоплением клеток от метафазы через телофазу очень похож на фенотипы, описанные для других моторных субъединиц динеина у Drosophila и наблюдаемые для нокдаунов тяжелой цепи динеина в текущей системе. Хотя Ctp и DYNLL1 также были связаны с динеин-независимыми ролями во время митоза в Drosophila (Wang, 2011) и клетках млекопитающих, самым простым объяснением фенотипов, наблюдаемых в этом исследовании, является то, что потеря dASCIZ или Ctp нарушает деление клеток в результате зависимых от динеина дефектов митотического веретена.В этом смысле есть подозрение, что повышенная частота гибели клеток во время развития крыла после нокдауна dASCIZ или Ctp РНКи является следствием митотического блока, а не отражением роли в путях выживания клеток per se , как неспособность завершить митоз — известная причина апоптоза (Зайцева, 2014).

Поразительное различие между фенотипами РНКи Drosophila , о которых сообщалось в этом исследовании, и ранее описанными РНКи позвоночных или фенотипами нокаута заключается в том, что потеря dASCIZ вызывает выраженные, предположительно динеин-зависимые, митотические дефекты, тогда как фенотипы развития у мышей Asciz KO кажутся быть более ограниченным относительно специфическим органогенезом и дефектами В-лимфопоэза без явных митотических дефицитов.Возможное объяснение может заключаться в том, что Drosophila содержит единственный ген Ctp , тогда как млекопитающие содержат два гена, кодирующих DYNLL, из которых только Dynll1 регулируется с помощью ASCIZ. Таким образом, DYNLL2, который обычно экспрессируется на гораздо более низких уровнях, чем DYNLL1, и на который не влияет потеря ASCIZ, может обеспечивать буфер для митотических или других связанных с динеином функций DYNLL1 у ASCIZ-дефицитных мышей. Тем не менее, можно предположить, что потеря DYNLL1 может вносить вклад в аспекты фенотипа Asciz KO посредством др., Более тонких эффектов на функции митотического веретена.Например, предполагаемая роль динеинового комплекса в перестройке митотических веретен и клеточной полярности для асимметричных клеточных делений в нейробластах Drosophila или клетках млекопитающих может служить парадигмой отсутствия зачатков легких у мышей Asciz KO: возможно, респираторные предшественники, которые присутствуют у этих мышей, должны каким-то образом вращаться динеиновыми моторами или другим DYNLL1-специфическим эффектором для зачатков легких, чтобы выйти из вентральной энтодермы передней кишки? Хотя ответ на такие вопросы выходит за рамки настоящего исследования, текущие результаты обеспечивают прочную основу для будущих исследований по определению степени, в которой ASCIZ через DYNLL1 регулирует митотические и моторные функции динеина в клетках млекопитающих, а также для будущих исследований. в онтогенетические функции оси dASCIZ-DYNLL1 / Ctp в экспериментально более податливой модельной системе Drosophila (Зайцева, 2014).

Комплекс Ana2 / Ctp / Mud регулирует ориентацию веретена в нейробластах дрозофилы

Центриоли играют ключевую роль в зарождении сетей поляризованных микротрубочек. В активно делящихся клетках центриоли устанавливают биполярное митотическое веретено и необходимы для стабильности генома. Drosophila Anastral spindle-2 (Ana2) является консервативным фактором дупликации центриолей. Хотя недавняя работа продемонстрировала, что центриолярный комплекс Ana2-dynein light chain (LC8) является критическим для правильного позиционирования веретена в нейробластах, то как взаимодействуют Ana2 и LC8, еще предстоит установить.В этом исследовании изучали взаимодействие Ana2-LC8 и картировали два сайта связывания LC8 в центральной области Ana2, Ana2M (остатки 156–251). Ana2 LC8-связывающий сайт 1 содержит сигнатурный мотив TQT и надежно связывает LC8 (KD 1,1 мкмоль), в то время как сайт 2 содержит мотив TQC и связывает LC8 с более низким сродством (KD 13 мкмоль). Оба сайта связывания LC8 фланкируют предсказанную альфа-спираль с ~ 34 остатками. Представлены две независимые атомные структуры димеров LC8 в комплексе с пептидами сайта связывания 1 и сайта 2 Ana2.Пептиды Ana2 образуют бета-нити, которые расширяют центральный составной бета-сэндвич LC8. LC8 распознает сигнатурный мотив TQT в первом сайте связывания LC8 Ana2, образуя обширные ван-дер-ваальсовы контакты и водородные связи с пептидом, в то время как мотив TQC сайта 2 Ana2 образует уникально протяженную бета-цепь, не наблюдаемую в других легких цепях-мишенях динеина. комплексы. Эксклюзионная хроматография в сочетании с многоугловым статическим светорассеянием демонстрирует, что димеры LC8 связывают сайты Ana2M и индуцируют тетрамеризацию Ana2 с образованием комплекса Ana2M4-LC88.LC8-обусловленная олигомеризация Ana2, вероятно, усиливает авидность Ana2 к факторам связывания центриолей и может связывать множественные факторы, как требуется во время позиционирования веретена и биогенеза центриолей (Slevin, 2014).

Ana2 является неотъемлемым компонентом пути удвоения центриолей, но как он работает с Sas-6 и Sas-4 и играет ли роль LC8 в этом пути, еще предстоит определить. Взаимодействия димеров Sas-6, которые способствуют формированию колеса тележки, очень слабы ( K D > 100 мкм), что делает маловероятным, что Sas-6 может спонтанно строить колеса тележки в клеточном контексте на эндогенных уровнях.Кроме того, сверхэкспрессия Sas-6 способствует амплификации центриолей только тогда, когда ко-сверхэкспрессия Ana2 является совместной, это указывает на то, что Ana2 играет поддерживающую роль в усилении олигомеризации Sas-6 и образовании колеса телеги. Один механизм, с помощью которого Ana2 может способствовать олигомеризации Sas-6, был бы, если бы сам Ana2 был олигомерным. Эта идея подтверждается недавними доказательствами того, что Ana2 связывает LC8, легкую цепь динеина, которая играет повсеместную роль в качестве машины димеризации (Wang, 2011). Эта работа обеспечивает понимание четвертичной структуры Ana2-LC8 и создает основу, на которой можно исследовать эффекты авидности тетрамера Ana2 на олигомеризацию Sas-6 (Slevin, 2014).

Это исследование идентифицировало два сайта связывания LC8 в Ana2, консервативных в пределах рода Drosophila , которые фланкируют центральный домен с предсказанной спиральной структурой. Хотя точные сайты связывания не очевидны у других видов многоклеточных, наличие центральной спиральной спирали предсказано. консервативен в ортологах Ana2 от C. elegans, Sas-5 до человеческого STIL, и предполагает роль в олигомеризации. Это подтверждается отчетом о том, что C.elegans Sas-5 N-концевая область (содержащая центральную предсказанную спиральную спираль) образует тетрамер в растворе. Хотя Sas-5 тетрамеризация in vitro не является LC8-зависимой, ее олигомерное состояние параллельно LC8-зависимой тетрамеризации, которая наблюдалась с Ana2 (Slevin, 2014).

Легкие цепи динеина часто связывают мишени, проксимальные к эндогенному домену олигомеризации, усиливая димеризацию мишени. Оба сайта связывания Ana2 LC8 представляют собой смесь канонических K -3 X -2 T -1 Q 0 T 1 и G -2 I -1 Q 0 V 1 D 2 LC8-связывающие мотивы.Используя ITC, это исследование показало, что Ana2 pep1 связывает LC8 с микромолярным сродством ( K D = 1,1 мкм). Кристаллическая структура LC8, связанного с Ana2 pep1, демонстрирует режим связывания LC8 2 -Ana2 pep1 2 , при этом каноническая последовательность TQT Ana2 pep1 вносит вклад в ключевые детерминанты связывания (Slevin, 2014).

Второй идентифицированный сайт связывания LC8 (сайт 2 Ana2, pep2) фланкирует С-концевую область центрального спирального домена и состоит из последовательности T -3 G -2 T -1 Q 0 С 1 Д 2 .Ana2 pep2 связывает LC8 с более низким сродством ( K D = 13 мкм), чем Ana2 pep1. Кристаллическая структура LC8, связанная с Ana2 pep2, также имеет режим связывания LC8 2 -Ana2 pep2 2 . Интересно, что Ana2 pep2 при связывании с LC8 принимает уникальную архитектуру, которая контрастирует с другими структурами LC8-пептида. Ana2 pep2 Cys 244 в положении +1 расположен глубже в канавке связывания LC8. Сродство, сообщаемое для взаимодействий пептидов LC8-Ana2, вероятно, недооценивает стабильность биологического комплекса, включающего полноразмерные Ana2 и LC8.Поскольку исследования раствора подтверждают взаимодействия между гомодимерами LC8 и тетрамерной областью Ana2M, ожидается, что эффекты авидности будут увеличиваться. стабильность комплекса превышает сродство, указанное для LC8 и Ana2 pep1 и pep2. Это согласуется с открытием, что стабильный комплекс Ana2-LC8 можно экстрагировать из клеточного лизата Drosophila . Отмечено, что в пределах рода Drosophila два сегмента, которые соединяют предсказанную центральную спиральную спираль с двумя фланкирующими сайтами связывания LC8, не консервативны. в последовательности или длине.Предполагается, что эти сегменты служат в качестве общих спейсеров, которые связывают сайты связывания LC8 с доменом олигомеризации спиральной спирали Ana2 и поддерживают общую длину, которая позволяет гомодимерам LC8 связывать и усиливать олигомеризацию Ana2. без стерически компромисса образования спирали (Slevin, 2014).

Данные подтверждают модель, в которой LC8 стабилизирует тетрамер Ana2. Тетрамер Ana2 может пространственно упорядочивать свои консервативные С-концевые мотивы STAN для взаимодействия с Sas-6 и стимулирования Sas-6. олигомеризация, лежащая в основе образования центриольного колеса тележки.SEC-MALS-анализ комплекса Ana2M-LC8 выявляет стабильный одновидовой комплекс, состоящий из четырех молекул Ana2M и восьми молекул LC8 (Ana2M 4 -LC8 8 ). Этот стабильный комплекс очищали на двух последовательных калибровочных колонках, демонстрируя его готовность к образованию, и дали аналогичную экспериментальную массу в двух независимых очистках и анализах SEC-MALS. Мутация первого сайта связывания Ana2M LC8, а также добавление тега SNAP к LC8 поддерживает стехиометрию Ana2M 4 -LC8 8 (Slevin, 2014).

Взаимодействия Ana2-LC8, которые были охарактеризованы в этом исследовании, поднимают важные вопросы о роли Ana2 в дупликации центриолей. Предыдущая работа показала, что C-концевая половина Ana2 связывает N-конец Sas-6 в Drosophila , указывая на возможную роль консервативного домена STAN Ana2 в связывании Sas-6. В этой модели LC8 связывает и стабилизирует тетрамер Ana2, который может структурно организовывать четыре транс-STAN домена на одном конце параллельного тетрамеризационного домена или два транс-STAN-домена на любом конце антипараллельного тетрамеризационного домена.В любой конфигурации олигомерное состояние Ana2 в сочетании с его способностью связывать Sas-6, как предполагается, усиливает олигомеризацию Sas-6 и образование колеса телеги. Это коррелирует с клеточными исследованиями, в которых двойная сверхэкспрессия Sas-6 и Ana2 необходима для образования колеса тележки, подтверждая, что Ana2 потенцирует образование колеса тележки Sas-6, потенциально посредством олигомеризации. Недавние криотомографические исследования зарождающейся архитектуры центриолей выявили плотность вспомогательного белка, соединяющего колесо тележки на основе Sas-6 с Sas-4 и дистальными триплетами микротрубочек.Учитывая интегральную роль Ana2 в формировании колеса тележки Sas-6, а также доказательства того, что он связывает как Sas-6, так и Sas-4, Ana2 является вероятным кандидатом на эту плотность. Необходима дополнительная работа, чтобы определить, может ли Ana2 соединять Sas-6 и Sas-4 и играет ли взаимодействие LC8-Ana2 роль в этой функции Ana2, как это происходит в асимметричном делении клеток нейробластов. Эта работа очерчивает структурную основу взаимодействия LC8-Ana2, с последствиями для его роли в структуре и функции Ana2 в центриоле (Slevin, 2014).

Комплекс Ana2 / Ctp / Mud регулирует ориентацию веретена в нейробластах дрозофилы

Нервные стволовые клетки дрозофилы, нейробласты головного мозга личинок (NB), выравнивают свои митотические веретена вдоль апикальной / базальной оси во время асимметричного деления клеток (ACD) для поддержания баланса самообновления и дифференцировки. Это исследование идентифицировало белковый комплекс, состоящий из анастрального веретена 2, супрессора опухолей (Ana2), белка легкой цепи динеина Cut up (Ctp) и дефекта грибовидного тела (Mud), который регулирует ориентацию митотического веретена.Были выделены два аллеля ana2 , которые демонстрировали фенотипы неправильной ориентации веретена и чрезмерного роста NB в мозге личинок. Центриолярный белок Ana2 прикрепляет Ctp к центриолям во время ACD. Центриолярная локализация Ctp важна для ориентации веретена. Ana2 и Ctp локализуют грязь в центросомах и клеточной коре и способствуют / поддерживают ассоциацию грязи со штырями в апикальной коре. Эти находки показывают, что центросомные белки Ana2 и Ctp регулируют функцию Mud, чтобы ориентировать митотическое веретено во время асимметричного деления NB (Wang, 2011).

Личиночные нейральные стволовые клетки головного мозга Drosophila , или нейробласты (NB), недавно появились в качестве новой модели для изучения самообновления стволовых клеток и туморогенеза. NBs делятся асимметрично с образованием самообновляющейся дочерней NB и материнской клетки ганглия (GMC), которая предана дифференцировке. Асимметричный механизм локализации / сегрегации обеспечивает поляризованное распределение «факторов пролиферации», включая атипичную протеинкиназу C (aPKC), и «факторов дифференциации», включая базальные белки, такие как Numb, Miranda (Mira), опухоль мозга (Brat) и Prospero. , дочери NB и GMC соответственно.Нарушение асимметричного деления NBs может привести к их гиперпролиферации и индукции опухолей (Wang, 2011).

Чтобы гарантировать правильную асимметричную сегрегацию детерминант судьбы клетки, митотическое веретено должно быть правильно ориентировано относительно поляризованных белков в коре клетки. Inscuteable (Insc) и гетеротримерные G белки Gαi и Gβγ и их регуляторы Partner of Insc (Pins) и Ric-8 контролируют ориентацию митотического веретена (Wang, 2011).

Недавняя работа также вовлекла ассоциированные с центросомами белки в регуляцию ориентации веретена и онкогенеза. Центросомы функционируют как основные центры организации микротрубочек в большинстве клеток животных. Центросома состоит из пары центриолей, окруженных аморфной матрицей перицентриолярного материала (ПКМ). Дупликация центриолей регулируется центриолярными компонентами, такими как Asterless (Asl), Sas6, Sas4 и анастральное веретено 2 (Ana2). ana2 был идентифицирован с помощью скрининговых РНК-интерференций (RNAi) по всему геному, где ana2 RNAi-обработанные S2-клетки проявляли фенотип анастрального веретена.Фенотип сверхэкспрессии Ana2 и его взаимодействие с Sas6 подтвердили роль Ana2 в дупликации центриолей (Stevens, 2010). Однако мутанты ana2 ранее не были доступны для дальнейших функциональных исследований (Wang, 2011).

В этом исследовании были выделены два аллеля ana2 , которые нарушают ориентацию апикального / базального веретена во время асимметричного деления NB. Показано, что Ana2 является супрессором опухолей, который подавляет чрезмерную пролиферацию NB.Центриолярный белок Ana2 напрямую взаимодействует с Ctp, легкой цепью динеина, которая также локализуется в центриолях, и Mud, что приводит к их локализации в центросомах. Это открытие указывает на то, что опухолевый супрессор Ana2 в конечном итоге регулирует функцию Mud, чтобы направлять асимметричное деление и предотвращать образование опухолей (Wang, 2011).

Это исследование исследовало роль Drosophila Ana2 во время асимметричного деления клеток NB, фокусируясь на ориентации митотического веретена.Два аллеля ana2 были выделены из генетического скрининга, который продуцировал избыточные NBs в мозге личинок и не смог правильно выровнять митотическое веретено с асимметрично локализованными белками. Было продемонстрировано, что Drosophila Ana2 функционирует как опухолевый супрессор в эксперименте по трансплантации. Используя мутанты ana2 и , было показано, что Ana2 важен для функции центриолей. Ana2 взаимодействует с Sas-6 через C-концевую область Ana2 (201-420 аминокислотных остатков), которая содержит консервативный мотив STAN и домен спиральной спирали (Stevens, 2010).Данные предполагают, что N-конец Ana2 (1-274 а.о.), который взаимодействует с Ctp, a Ddlc1 (легкая цепь Drosophila Dynein), достаточен для его функции в сборке центриолей и ориентации веретена. Это не находится в прямом противоречии с взаимодействием между Ana2 и Sas6, потому что C-концевой участок Ana2 (201-420 аминокислотных остатков), который взаимодействует с Sas-6, частично перекрывается с Ana2 N1 (1-274 аминокислотных остатка). Однако этот результат неожиданно указывает на то, что мотив STAN может быть незаменим для функции Ana2 во время образования центриоли.Связанный с Ana2 белок STIL млекопитающих, который также содержит мотив STAN, вовлечен в первичную микроцефалию, нарушение развития нервной системы, характеризующееся уменьшенным размером мозга. Очевидно несопоставимые фенотипы, описанные для STIL млекопитающих и Ana2 мух во время развития мозга, вероятно, обусловлены разными контекстами развития (Wang, 2011).

Причина, по которой чрезмерная пролиферация NB происходит у мутантов ana2 , но не у мутантов без звездочек или sas4 с дефектами веретена или центриолей, может быть связана с различным поведением этих мутантов в «спасении телофазы», ​​явлении, при котором белки делокализованы. из коры во время раннего митоза восстанавливаются в анафазе / телофазе с помощью плохо изученного компенсаторного механизма.Фенотип неправильной ориентации веретена у мутантов ana2 намного более серьезен, чем у мутантов sas4 или asterless . Вероятно, как следствие относительно слабого фенотипа разориентации веретена, «спасение телофазы» все еще происходило в 100% asterless и sas4 мутантных телофазных NBs, и все асимметрично локализованные белки были правильно сегрегированы в разные дочерние клетки. Напротив, у мутантов ana2 или мутантов mud , которые имеют избыточный рост NB в личиночном мозге, асимметрично локализованные белки иногда неправильно сегрегируют на разных дочерей в телофазе (Wang, 2011).

Экран RNAi идентифицировал Ctp как важный игрок в ориентации митотического веретена, потому что мутанты ctp обнаруживают разориентацию веретена во время асимметричного деления NB. ctp нулевые мутанты обнаруживают разориентацию веретена в NB, аналогичную той, что наблюдается в ctp RNAi. Отмечено, что Ctp локализуется в центриолях Drosophila . Ana2 непосредственно связывает и прикрепляет Ctp к центриолям во время деления NB. Локализация центриоли важна для функции Ctp во время ориентации веретена, потому что нацеленный на мембрану Ctp CAAX не в состоянии спасти фенотип разориентации веретена у нулевого мутанта ctp .Взаимодействие между Ctp и Ana2 на центриолях может быть критическим для dynein, чтобы организовывать астральные микротрубочки и перемещать свои грузовые белки вдоль микротрубочек (Wang, 2011).

Компонент динеина, Ctp, также может напрямую связываться с Mud, белком, расположенным ниже гетеротримерного G-белка, который регулирует ориентацию веретена. Это взаимодействие сохраняется у позвоночных; Xenopus NuMA, белок, связанный с грязью, также образует комплекс с динеином. Ana2 и Ctp важны для локализации Mud на полюсах веретена во время ориентации веретена в NBs, тогда как Mud не требуется для центриолярной локализации Ana2 или Ctp.Ana2 также напрямую взаимодействует с Mud. Эти данные подтверждают, что Mud может быть важной нижестоящей мишенью для Ana2 и Ctp во время ориентации веретена. Ana2, Ctp и Mud также обнаруживаются в одном и том же белковом комплексе in vivo и in vitro. Грязь участвует во взаимодействии полюса веретена / центросомы, о чем не сообщалось в предыдущих анализах функции грязи. Ana2 и Ctp также играют сходную роль во время прикрепления полюса веретена к центросоме. Вместе эти данные указывают на то, что комплекс Ana2, Ctp и Mud функционирует, чтобы регулировать сборку полюсов веретена и ориентацию веретена во время асимметричного деления NBs (Wang, 2011).

Ориентация апикального / базального веретена контролируется двухступенчатым механизмом: раннее центросомозависимое выравнивание и более позднее взаимодействие веретена и коры головного мозга. Данные указывают на то, что Ana2 критически важен не только для ранней, зависимой от центросомы стадии, но также и для более позднего взаимодействия веретена и коры головного мозга. Хотя потеря функции Ana2 или Ctp не влияет на асимметричную локализацию штифтов в NB, Ana2 и Ctp, по-видимому, важны для взаимодействия между штифтами и грязью в мозге личинок, поскольку взаимодействие штифтов и грязи ослаблено в ana2 или insc-Ctp. CAAX , ctp мутантный мозг личинок.Эти находки подтверждают, что комплекс Dynein-Dynactin кооперируется с центриолярным белком Ana2, чтобы опосредовать взаимодействие веретена и коры головного мозга. Взаимодействие веретена и коры головного мозга может потребовать механизма «поиска и захвата», управляемого положительным концом микротрубочки-связывающего белка EB1 и комплекса динеин-динактин). Предполагается, что Ana2 и Ctp могут участвовать в таком механизме «поиска и захвата» во время ориентации апикобазального веретена (Wang, 2011).

Эти данные подтверждают, что мультипротеиновый комплекс, состоящий из Ana2, Ctp и Mud, является критическим во время регуляции ориентации веретена.Ana2 и Ctp регулируют локализацию грязи на центросомах / полюсах веретена, а также в коре клеток, тогда как путь гетеротримерного G-белка важен только для локализации кортикальной грязи. Т.о., центросомный комплекс Ana2 / Ctp / Mud сходится с путём гетеротримерного G-белка во время ориентации веретена. Очень мало известно о молекулярных механизмах, с помощью которых центросомные белки регулируют ориентацию веретена. Было показано, что Aur-A, белок PCM, фосфорилирует штифты на S436 домена линкера штифтов, который необходим для точной ориентации веретена.Текущие находки подтверждают важные функциональные связи между центриолярным белком Ana2, динеиновым комплексом и Mud во время асимметричного деления NBs. Это повышает вероятность того, что сходный механизм, посредством которого центросомные белки взаимодействуют с динеиновыми комплексами, чтобы обеспечивать локализацию кортикальных белков, может существовать во время асимметричного деления и самообновления стволовых клеток у млекопитающих (Wang, 2011).

Функции легкой цепи динеина 1 в клетках соматической кисты регулируют деление сперматогониальных клеток у Drosophila

Потомство стволовых клеток перед дифференцировкой часто претерпевает транзитные амплифицирующие деления.У дрозофилы предшественник сперматогониальных клеток делится четыре раза внутри клетки, образованной двумя кистами соматического происхождения, прежде чем дифференцироваться в сперматоциты. Хотя известно, что факторы зародышевой линии и клетки кисты регулируют эти деления, механистические детали неясны. Это исследование показывает, что потеря динеина-легкой цепи-1 (DDLC1 / LC8) в клетках кисты устраняет экспрессию bag-of-marbles (bam) в сперматогониях, вызывая гиперплазию гониальных клеток в семенниках дрозофилы.Фенотип преимущественно усиливается аллелями потери функции Dhc64C (цитоплазматический динеин) и дидум (миозин V). Потеря DDLC1 или миозина V в клетках кисты также влияет на их дифференцировку. Более того, клеточно-специфическая потеря ddlc1 нарушает локализацию Armadillo, DE-кадгерина и Integrin-betaPS в кисте. Вместе эти результаты подтверждают, что активности Dynein и Myosin V, а также независимые функции DDLC1 в клетках кисты организуют соматическое микроокружение, которое регулирует пролиферацию и дифференцировку сперматогониальных клеток (Joti, 2011).

Легкая цепь динеина 1 необходима для аутофагии, выведения белка и гибели клеток у дрозофилы

Аутофагия — это катаболический путь, который важен для обмена долгоживущих белков и органелл и участвует в выживании клеток, прогрессировании опухоли, защите от инфекции, нейродегенерации и гибели клеток. Аутофагия и каспазы необходимы для аутофагической гибели клеток типа II слюнных желез личинок дрозофилы во время развития, но механизмы, которые регулируют эти пути деградации, не изучены.В этом исследовании был проведен прямой генетический скрининг генов, необходимых для гибели клеток слюнных желез, и была идентифицирована легкая цепь динеина 1 (ddlc1) Drosophila как ген, необходимый для гибели клеток типа II. Аутофагия ослаблена у мутантов ddlc1 , но каспазы активны в этих клетках. ddlc1 мутантные слюнные железы развивают большие фибриллярные белковые включения, которые окрашиваются положительно на амилоид-специфические красители и убиквитин. Эктопическая экспрессия Atg1 достаточна, чтобы вызвать аутофагию, очистить белковые включения и спасти деградацию мутантных слюнных желез ddlc1 .Кроме того, мутантные личинки ddlc1 обладают пониженной подвижностью, а мутации в ddlc1 усиливают нарушение подвижности, которое наблюдается в модели нейродегенеративного заболевания у дрозофилы. Важно отметить, что это снижение подвижности личинок связано со снижением клиренса белка с экспансией полиглутамина, накоплением p62 в нейронах и мышцах и меньшим количеством синаптических бутонов. Эти результаты показывают, что DDLC1 необходим для выведения белка за счет аутофагии, что связано с гибелью аутофагических клеток и нейродегенерацией (Batlevi, 2010).

Эгалитариан связывает легкую цепь динеина для установления полярности ооцита и поддержания судьбы ооцита

Во многих типах клеток поляризованный транспорт направляет движение мРНК и белков от места их синтеза к участку действия, тем самым обеспечивая клеточную полярность. В этом процессе участвует цитоплазматический моторный комплекс микротрубочек динеина. У Drosophila белки Egalitar (Egl) и Bicaudal-D (BicD) также важны для транспорта макромолекул к ооциту и к апикальной поверхности зародыша бластодермы.Следовательно, Egl и BicD, которые, как было показано, ассоциированы, могут быть частью консервативного аппарата центральной локализации у Drosophila, хотя прямая ассоциация между этими молекулами и моторным комплексом dynein не была показана. Это исследование сообщает, что Egl взаимодействует напрямую с легкой цепью динеина дрозофилы (Dlc), моторным компонентом микротрубочек, через домен Egl, отличный от того, который связывает BicD. Предполагается, что комплекс Egl-BicD загружается через Dlc на моторный комплекс динеина, тем самым облегчая транспортировку груза.В соответствии с этой моделью точечные мутации, которые специфически нарушают ассоциацию Egl-Dlc, также нарушают микротрубочко-зависимый транспорт как в ооцит, так и внутри него, что приводит к потере поддержания судьбы и полярности ооцитов. Эти данные обеспечивают прямую связь между молекулой, необходимой для спецификации ооцитов, и моторным комплексом микротрубочек и подтверждают гипотезу, что транспорт, опосредованный микротрубочками, важен для сохранения судьбы ооцитов (Navarro, 2004).

Функция динеин-динактина и сенсорный рост аксонов во время метаморфоза дрозофилы: роль ретроградных двигателей

Мутации в генах компонентов комплекса динеин-динактин нарушают поиск путей аксонов и синаптогенез во время метаморфозы в центральной нервной системе дрозофилы.Чтобы лучше понять функции этого ретроградного двигателя в Сборка нервной системы, поиск путей и ветвление сенсорных аксонов во время метаморфоза были проанализированы у диких и мутантные фоны. У особей дикого типа сенсорные аксоны сначала достигают ЦНС через 6-12 ч после образования пупария и развиваются. их конечные ветки в течение следующих 48 часов. In Glued 1 и Цитоплазматический динеин легкой цепи мутанты, проприоцептивные и тактильные аксоны поступают в ЦНС вовремя, но обнаруживают дефекты конечных ветвлений, которые усиливаются до 48 часов после пупария. формирование.Результаты показывают, что рост аксонов у этих мутантов происходит по расписанию, но последний процесс терминального ветвления, синаптогенез и стабилизация этих сенсорных аксонов требует комплекса динеин-динактин. Поскольку этот комплекс функционирует как ретроградный мотор, предполагается, что ретроградный сигнал должен быть доставлен в ядро ​​для надлежащего прекращения некоторых сенсорные нейроны (Murphey, 1999).

Мутации цитоплазматического динеина ( ddlc1 ) вызывают морфогенетические дефекты и апоптотическую гибель клеток у Drosophila melanogaster

Молекулярная и генетическая характеристика гена легкой цепи цитоплазматического динеина, ddlc1 , из Drosophila melanogaster . ddlc1 кодирует первую идентифицированную легкую цепь цитоплазматического динеина, и ее генетический анализ представляет собой первую идентифицированную легкую цепь in vivo характеристика функции цитоплазматического динеина у высших эукариот. Ген ddlc1 отображается на 4E1-2 и кодирует 89-аминокислотный полипептид с высоким сходством с аксонемной легкой цепью динеина внешнего плеча массой 8 кДа из жгутиков Chlamydomonas. Нозерн-блот-анализ развития (РНК) и гибридизации in situ РНК яичников и эмбрионов показывают, что ген ddlc1 является выражается повсеместно.Анализы антител против DDLC1 показывают, что белок DDLC1 локализован в цитоплазме. Мутации с частичной потерей функции, вызванные Р-элементом, вызывают плейотропные морфогенетические дефекты в развитии щетинок и крыльев, так как а также в оогенезе и, следовательно, приводят к женскому бесплодию. Морфологические аномалии яичников всегда связано с потерей клеточной формы и структуры, что визуализируется дезорганизацией актинового цитоскелета. Мутации с полной потерей функции вызывают летальный исход.Большая часть мутантных животных дегенерирует во время эмбриогенеза, и умирающие клетки демонстрируют морфологические изменения, характерные для апоптоза, а именно клеточную и ядерную конденсацию и фрагментацию, поскольку а также деградация ДНК. Клонирование человеческого гомолога гена ddlc1 , hdlc1 , демонстрирует, что легкая цепь динеина 1 является хорошо сохраняется у мух и людей. Нозерн-блоттинг и мечение эпитопов показывают, что ген hdlc1 повсеместно экспрессируется и что легкая цепь 1 динеина человека локализована в цитоплазме. hdlc1 соответствует 14q24 (Dick, 1996).

Мутации в гене легкой цепи динеина 8 кДа нарушают проекции сенсорных аксонов в имагинальной ЦНС дрозофилы

Мутации в легкой цепи цитоплазматического динеина 8 кДа (8×10 (3) Mr) нарушают сенсорные траектории аксонов в имагинальной нервной системе. система дрозофилы. Слабые аллели являются мутантными по поведению, стерильны самками и демонстрируют истончение щетины и ее потерю.Нулевые аллели смертельны на поздних стадиях куколки и изменяют анатомию нейронов в имагинальной ЦНС. Вставки P [Gal4] использовались для исследования аксона. проекции нейронов рецептора растяжения и конструкция engrailed-lacZ была использована для характеристики анатомии тактильных нейронов. В мутанте У животных оба типа сенсорных нейронов обнаруживают измененные траектории аксонов в ЦНС, что указывает на дефект в поиске пути аксонов. Однако изменения траектории аксонов не препятствовали достижению этими аксонами своих нормальных областей терминации.в Для аллелей, продуцирующих эти нейрональные фенотипы, экспрессия гена легкой цепи цитоплазматического динеина 8 кДа полностью отсутствует. Эти результаты демонстрируют новую функцию легкой цепи цитоплазматического динеина в регуляции аксоногенеза и могут обеспечивать точка входа для исследований роли клеточных моторов в управлении конусами роста (Phillis, 1996).

Поток — это не перфузия, а перфузия — не функция: дополнительное тестирование для диагностики смерти мозга

Смерть по неврологическим критериям — это в основном клиническое определение, основанное на постоянном отсутствии способности к сознанию и арефлексии ствола мозга.При наличии неразрешимых сомневающихся факторов или невозможности завершить клиническую оценку использование дополнительных тестов остается непростым требованием. Мы предлагаем концептуальную основу для четкого разделения мозгового потока, перфузии и функции. Функционирование мозга требует перфузии, а перфузия требует потока. Тем не менее, наличие кровотока не говорит о перфузии, а наличие перфузии не свидетельствует о функции. Идеальный вспомогательный тест должен быть быстрым, безопасным, легкодоступным, неинвазивным, недорогим и не подверженным влиянию факторов.7 Кроме того, идеальный тест должен быть как можно ближе к оценке несмешиваемой функции и должен воздерживаться от использования потока в качестве суррогата. Такой идеальный тест еще не утвержден.

Le décès déterminé par des critères nerologiques (DDN), communément appelé «mort cérébrale» (MC), является определенным в связи с неотвратимым прекращением совести и ответами на cérébral de troncérébral dans unconxte cérébral de la cérébral dans unconxte клинический факультативный и правдоподобный de confusion means.1,2,3,4,5 En d’autres mots, il s’agit de l’arrêt définitif de la fonction du tronc cérébral, résultant le plus souvent d’une lésion cérébrale primaire dévastatrice.Par conséquent, la pierre angulaire de la détermination de la MC / DDN consiste à démontrer le dysfonctionnement du système d’activation réticulaire ascendant (coma) et des noyaux du tronc cérébral (отсутствие рефлексов для нервных нервов, безразличных) par un examen телосложение.

Depuis sa première description en 1968,6 notre compréhension de la mort Neurologique evolué en parallèle au développement de nouvelles modalités de нейровизуализации. Первоначальная концепция Malgré leur, удовлетворяющая экзаменуемому телосложению, проверяет, как оценивает кровообращение, перфузию и не завершает проверку.Nous définissons la циркуляция, соответствующая движению sang détecté par l’opacification des vaisseaux majeurs du cerveau (artères et veines) в ле études de flux sanguin, tandis que la перфузия, имплементирующая беспорядочное обращение au niveau des capillaires dans le cible (dans ce cas, le cerveau). Циркуляция и перфузия не являются необходимыми для работы в нейрональной клинике, организуемой по принципу «tronc cérébral.Bien que ces paramètres soient sizes d’un point de vue Physiologique, la littérature comporte plusieurs cas d’inxactitude dans la nomenclature et son interprétation, les termes «циркуляция», «перфузия» и «fonction», взаимозаменяемы. 4,7,8,9 Par example, on use fréquemment le terme de perfusion pour désigner la циркуляция, ce qui peut mener à la завершение erronée que la présence de циркуляции или перфузии sont des signes définitifs de fonction. Toute fonction cérébrale nécessite une perfusion, et la perfusion nécessite une циркуляция.Неанмуны, обнаружение циркуляции ne veut pas dire qu’il y ait perfusion, et la detection d’une perfusion ne signifie pas nécessairement qu’il y ait fonction. Ainsi, des définitions claires de cycle, de perfusion et de fonction pourraient améliorer la compréhension des tests compémentaires, promouvoir d’autres recherches afin d’identifier un test idéal et standardiser l’utilisation de tests dans les soins aux пациента.

Pour illustrer les différences fondamentales entre ces trois paramètres, nous offers un modèle graphique conceptuel, soit celui d’une fleur arrosée par un boyau d’arrosage (рисунок).Dans ce modèle, la fleur représente le cerveau et le tronc cérébral. Pour atteindre la fleur, l’eau doit d’abord passer dans le boyau d’arrosage (циркуляция) puis être acheminée à la fleur (перфузия). Dans le cas d’une MC / DDN, l’important est de déterminer si le cerveau et le tronc cérébral cessent de fonctionner, ce qui équivaut à démontrer que la fleur est morte, независимость que l’eau coule dans le boyau ou atteigne la флер.

Плюс-статьи, которые проходят в прошлом году, посвящены анализу дополнительных тестов, используемых для определения и определения неврологических нарушений.1,7,10 Напоминаем о публикации результатов испытаний MC / DDN в кадрах World Brain Death Project от Greer et collègues, которые представляют собой подобие использования и предпринимательства для комплементов тестов, которые являются достойными включает в себя и полемику. 11 Nous présentons ici une brève — оценка критики определенных проверок, tout en предложение нового подхода к концептуальным и физиологическим различиям в кровообращении, перфузии и церебральной функции (таблица 1).Мы предлагаем разработку актуальных определений обращения, перфузии и функций, основанных на концептуальных моделях (таблица 2).

ТАБЛИЦА 1 Сравнительный качественный эмпирический анализ дополнительных тестов для твердой сердцевины / детерминированных детерминированных критериев неврологических исследований ТАБЛИЦА 2 Предложения по определениям, которые были определены в качестве проверяющих лиц 900TP, проверяющих , проверенных на . аспартат-транскарбамоилазы на JSTOR
Абстрактный

Аллостерический контроль аспартат-транскарбамоилазы (ATCase, EC 2.1.3.2) Escherichia coli включает подавление обратной связи как CTP, так и UTP, а не только CTP. Было известно, что CTP действует как гетеротропный ингибитор катализа; однако ингибирование только CTP является неполным (50-70% при различных концентрациях аспартата), и существует только частичное заполнение сайтов связывания аллостериков CTP при насыщающих концентрациях. Логика этих аллостерических характеристик теперь может быть понята в том, что UTP является синергическим ингибитором ATCase в присутствии CTP, даже если UTP не имеет независимого эффекта при pH 7.0. Когда присутствуют насыщающие концентрации CTP, концентрация субстрата, необходимая для полумаксимальной активности (S 0,5 ) нативного холофермента для аспартата, увеличивается с 5 до 11 мМ. Когда присутствуют и CTP, и UTP, потребность в аспартате еще больше возрастает (S 0,5 = 17 мМ). При концентрациях аспартата

Информация о журнале

PNAS — это самый цитируемый в мире междисциплинарный научный сериал. Он публикует высокоэффективные исследовательские отчеты, комментарии, мнения, обзоры и т. Д. доклады коллоквиума и акции Академии.В соответствии с руководящими принципы, установленные Джорджем Эллери Хейлом в 1914 году, PNAS издает краткие первые объявления членов Академии и иностранных партнеров подробнее важный вклад в исследования и работу, которая, по мнению Участника, иметь особое значение.

Информация об издателе

Национальная академия наук (НАН) — это частная некоммерческая организация ведущих исследователей страны.

alexxlab / 31.07.1974 / Разное

Добавить комментарий

Почта не будет опубликована / Обязательны для заполнения *