Отсутствие осаго: нюансы, о которых стоит знать :: Autonews

Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО

Подборка наиболее важных документов по запросу Ответственность за отсутствие полиса ОСАГО (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

В 39 регионах России зафиксировано увеличение количества водителей без ОСАГО

В связи с ростом в ряде регионов страны количества нарушителей, предпочитающих ездить без ОСАГО, в «Югории» также зафиксировали рост интереса клиентов к мультипродуктам, которые появляются на стыке нескольких выплатных случаев, либо при возникновении проблемной страховой ситуации у, как минимум, одной из сторон. Так уже на протяжении семи лет сохраняет популярность продукт компании «Ремонт у дилера», который в 2020 г.

22 августа 2021 г. вступит в силу важное изменение в заключении договора ОСАГО. Страховым компаниям при заключении договора ОСАГО будет уже не важно, проходил ли автомобиль технический осмотр. Купить полис ОСАГО можно будет без этой процедуры.

«С последних тарифных реформ прошёл уже ровно год. За это время средняя стоимость полиса ОСАГО практически не изменилась по рынку, но поменялась структура: молодые и неопытные водители стали платить примерно на 20% больше, а для опытных и аккуратных страховка и наоборот стала дешевле, примерно на 10%. Думаем, что эта тенденция на рынке сохранится и в дальнейшем, — прокомментировала заместитель генерального директора «Югории» Лусине Бундакова. — Что касается «Югории», отмена проверки техосмотра на стоимость ОСАГО не повлияет и для клиентов компании точно дороже не станет».

При этом, по мнению регионального директора, водителей без техосмотра меньше не станет, так как обязанность проходить ТО у автовладельцев остается.

«За непрохождение техосмотра будут предусмотрены большие штрафы, c 1 марта 2022 г. — 2000 р. Кроме того, страховые компании по-прежнему смогут предъявлять регресс водителям, попавшим в ДТП на машинах без техосмотра, — добавила Лусине Бундакова. — Поэтому гораздо спокойнее пройти техосмотр и не нарушать закон».

Камеры не должны штрафовать за отсутствие ОСАГО до марта 2022 года

Эксперт рассказал «5 колесу», что на практике означает продление, подписанное премьер-министром Мишустиным.

Редакция

Страховые компании перестали оформлять новые полисы ОСАГО. Официальная версия РСА – компании не могут получить данные о диагностических картах из ЕАИСТО — Единой автоматизированной системы технического осмотра.

Путаницу породило распоряжение премьер-министра Мишустина о продлении диагностических карт на полгода. Редакция «5 колеса» пообщалась с экспертом по регистрации изменений в конструкцию ТС, основателем сервиса 4-cars.ru Виталием Пелиховым. Он смог разъяснить несколько моментов. 

Продлить диагностическую карту до 01 октября по старым правилам не получится. Старой процедуры больше не будет, по крайней мере, пока не внесут изменения в законодательство. 

Если срок действия диагностической карты (ДК) заканчивается в период с 1 февраля по 1 октября 2021 года, её действие автоматически продлевается на 6 месяцев. То есть, если, например, автовладелец последний раз проходил ТО в июне 2020 года, ДК будет действительна по декабрь 2021, и в декабре нужно будет пройти процедуру техосмотра уже по новым правилам.

Если ДК закончилась до 1 февраля 2021 года и  автомобиль был выпущен  более 4 лет назад, придется пройти техосмотр по новым правилам — с фотографированием, геометками и полной проверкой по 80 пунктам.

Помните, что, например, по ГОСТу, мы не имеем право ездить без брызговиков, даже если в базовой комплектации машины их нет. И таких тонкостей — более 80 пунктов.

До 1 марта камеры не должны штрафовать за отстутсвие полисов ОСАГО. Однако, утверждать это не совсем правомерно: как настроят систему фото- и видеофиксации, непонятно. Не исключено, что камеры будут проверять номера машин по базе ЕАИСТО, где есть отметки, когда заканчивается ДК уже с учетом продления. 

Редакция рекомендует:

Хочу получать самые интересные статьи

Аспартаткарбамоилтрансфераза — обзор

14.

Типичного механизма точного контроля метаболизма не существует. Мы уже обсудили примеры множества регуляторных процессов, большинство из которых связаны с аллостерическими ферментами.

В предыдущем разделе (14.2.5) мы рассмотрели, как участие PFK и FBPase в бесполезном цикле обеспечивает очень чувствительный механизм метаболической регуляции.Мы также увидели, как ковалентная модификация ферментов, таких как мышечная гликогенфосфорилаза, может привести к усилению регуляции. Многие другие аллостерические ферменты действуют, не участвуя в таких системах.

Аспартат-карбамоилтрансфераза (ACTase) , также называемая аспартат-транскарбамоилаза (ATCase), из E. coli была первым ферментом, в котором было показано, что активный и регуляторный сайты четко разделены. Действительно, они не только находятся в разных частях молекулы, но и находятся в разных субъединицах (рис. 14.5). Хотя это облегчило исследование характеристик фермента, это необычное открытие. Большинство аллостерических ферментов представляют собой олигомеры, состоящие из идентичных субъединиц. ACTase катализирует реакцию:

Рис. 14.5. Упрощенное представление трехмерной структуры половины (c ₃ r ₃ ) молекулы E. coli ACTase, как было обнаружено в исследованиях дифракции рентгеновских лучей Lipscomb et al. (1978). Активные сайты находятся на границе раздела между соседними субблоками c или рядом с ним.Другой блок c ₃ r ₃ находится за показанным, контакт осуществляется через r субблоков. (Условные обозначения для рис. 2.10.)

Это первая в последовательности реакций, приводящих к биосинтезу пиримидиновых нуклеотидов UMP, UDP, UTP и, наконец, CTP. Два важных механизма контроля регулируют образование пиримидина в E. coli : синтез АКТазы подавляется в присутствии урацила, а конечный продукт метаболизма, ЦТФ, контролирует свой собственный синтез путем обратного ингибирования АКТазы. Джон Герхарт и Артур Парди (1962) показали, что ЦТФ увеличивает сигмоидальную природу графика Михаэлиса-Ментен для реакции, катализируемой АКТазой, при этом V _max не изменяется, тогда как активатор АТФ (пуриновый нуклеотид) снижает сигмоидальную природу кривой. Исходя из этого, они и другие разработали концепцию аллостерической регуляции.

Герхарт вместе с Говардом Шахманом диссоциировал фермент под действием p -меркурибензоата и показал, что один тип субъединицы (c) обладает всей каталитической активностью, а другой (r) содержит регуляторные сайты.Реакция, катализируемая в отсутствие регуляторных субъединиц, демонстрирует гиперболические характеристики и не зависит от АТФ или CTP.

Анализ последовательности Клаусом Вебером (1968) и исследования дифракции рентгеновских лучей Уильямом Липскомбом и сотрудниками (1968 и последующие годы) показали, что структура холофермента c ₃ (r ₂ ) ₃ c ₃ , два каталитических тримера (каждый по M _r 100 000), разделенные тремя регуляторными димерами (каждый по M _r 33 000). Структурная целостность холофермента стабилизируется ионами Zn ²⁺ (рис. 14.5).

Каждый регуляторный димер может связывать две молекулы CTP, но, хотя две субъединицы очевидно идентичны, сродство к первой молекуле CTP значительно выше, чем ко второй. Точного объяснения этой отрицательной гомотропной кооперативности еще предстоит найти. Также известно, что АТФ и CTP конкурируют за один и тот же сайт, вероятно, вызывая разные конформационные изменения при связывании.

Данные измерений остановленного потока и релаксации предполагают, что гомотропные взаимодействия (между каталитическими сайтами) включают согласованный механизм, тогда как гетеротропные взаимодействия (между каталитическими и регуляторными сайтами) включают механизм, который является последовательным. Впоследствии, в 1980-х годах, Эван Кантровиц, Уильям Липскомб и его коллеги использовали рентгеновскую кристаллографию и сайт-направленный мутагенез, чтобы продвинуться дальше. Выяснилось, что каждая каталитическая субъединица имеет отдельные домены для связывания субстратов аспартата и карбамоилфосфата, которые в Т-состоянии дальше друг от друга, чем в R-состоянии. Кроме того, в первом состоянии петля (остатки 230-245) каждой каталитической субблока образует связи с субблоком в каталитическом тримере напротив. В частности, глутамат-239 в петле взаимодействует как с лизином-164, так и с тирозином-165 в другой субъединице, чей глутамат-239, в свою очередь, взаимодействует с лизином-164 и тирозином-165 в первой субъединице. Для молекулы в целом происходит три таких набора взаимодействий, удерживающих два каталитических тримера близко друг к другу и затрудняющих доступ к активным центрам.Ни одно из этих взаимодействий не присутствует в R-состоянии, что позволяет тримерам раздвигаться и облегчать доступ к субстрату. Кроме того, аспартатный и карбамоилфосфатный домены каждой каталитической субъединицы сближены из-за взаимодействия между глутаматом-50 и аргинином-167 и аргинином-234, а также между серином-171 и глутамином-133 и гистидином-134. , помогая создать активный карман сайта. По этим и другим причинам R-состояние обладает гораздо большей каталитической активностью, чем T-состояние, и переход от T-состояния к R-состоянию происходит согласованным образом.

Модификаторы большинства аллостерических ферментов представляют собой относительно небольшие молекулы. Однако лактозосинтаза (раздел 5.2.3) является исключением. Хотя модификатор α-лактальбумин можно рассматривать как субъединицу фермента, он слабо связывается с другим белковым компонентом ( N -ацетилактозаминсинтаза / галактозилтрансфераза), но при этом полностью меняет специфичность фермент, позволяющий глюкозе действовать как субстрат. Джон Моррисон и Курт Эбнер (1971) на основании своих исследований пришли к выводу, что реакция протекает по механизму принудительного порядка, а именно:

Boopathy Ramakrishnan и Pradman Qasba (2001-3) показали, что связывание UDP-галактозы приводит к конформационным изменениям в активном центре фермента. В отсутствие α-лактальбумина глюкоза может связываться только временно, но она образует водородные связи с α-лактальбумином, если он присутствует, стимулируя дальнейшие корректировки активного сайта, которые максимизируют взаимодействие с глюкозой. Таким образом, молекула удерживается в подходящей ориентации достаточно долго для образования лактозы.

Мультиферментный комплекс пируватдегидрогеназы из E.coli (см. разделы 5.2.5 и 11.5.6) подлежит ингибированию конкурентным продуктом НАДН и ацетил-КоА. Кроме того, компонент E ₁ может быть активирован AMP и заблокирован GTP. Регуляция системы млекопитающих имеет сходные особенности, но более сложна, чем в E. coli : участвует ковалентная модификация, при этом в комплексе присутствуют ферменты киназа и фосфатаза . Лестер Рид (1974) показал, что киназа, связанная с ацетилтрансферазой (E ₂ ), инактивирует комплекс, катализируя фосфорилирование серинового остатка в пируватдегидрогеназном компоненте (E ₁ ).Эта киназа сама активируется ацетил-КоА и НАДН и ингибируется АДФ и пируватом. Фосфатаза, которая катализирует удаление этого фосфата, активируется Ca ²⁺ и Mg ²⁺ . Таким образом, повышенные соотношения [ATP] / [ADP], [NADH] / [NAD ⁺ ] и [acetyl-CoA] / [CoΔSH] в митохондриях, где расположен комплекс, будут иметь тенденцию к снижению его общей активности. Ситуация в таком мультиферментном комплексе, где метаболит передается непосредственно от одного фермента к другому, кажется идеальной для чувствительной регуляции метаболизма.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

CTP способствует эффективной ParB-зависимой конденсации ДНК, облегчая одномерную диффузию из parS

Существенные изменения:

Хотя рецензенты и рецензирующий редактор согласились с тем, что это очень тщательное, тщательно проведенное и важное исследование, они определили ряд проблем, которые необходимо решить:

1. Все рецензенты соглашаются с тем, что, если это возможно с разумными усилиями, авторы должны предоставить некоторые прямые данные о диффузии одиночных молекул, поскольку представленные данные подтверждают предложенное поведение, но не исключают все альтернативы.

Чтобы ответить на этот вопрос, мы изготовили биотинилированную версию ParB, которая будет помечена QD-стрептавидином. Мечение QD увеличивало интенсивность флуоресценции отдельного белка ParB и позволяло значительно увеличить время визуализации из-за отсутствия фотообесцвечивания. Мы также изготовили подложки, содержащие только 7 или 2 копии parS, чтобы увеличить наши шансы наблюдать отдельные события. Нам удалось наблюдать одномерную диффузию отдельных молекул ParB вдоль ДНК.Кимографы также показали четкое стабильное связывание на сайтах parS, что подтверждает наши предыдущие выводы. Мы разработали новое программное обеспечение для анализа этих кимографов и извлечения индивидуальных временных курсов ParB (то есть положения ParB вдоль ДНК в зависимости от времени). Кроме того, были рассчитаны константы диффузии для отдельных траекторий. Константа диффузии ParB составляла 0,41 ± 0,02 мкм2 с ^-1 (среднее ± среднеквадратичное, n = 177) или 3,5 ± 0,2 kbp2 с ^-1 , учитывая рост на пару оснований на 0,34 нм. Эти данные согласуются с предыдущими экспериментами с одной молекулой, проведенными в отсутствие CTP (Graham et al., 2014) и с недавно рассчитанной константой диффузии ParB 0,7 мкм2 с ^-1 с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения (Guilhas et al., 2020).

Эти новые данные прямо подтверждают наш вывод о распространении ParB с сайтов parS. Кроме того, теперь мы обеспечиваем измерение константы диффузии ParB в условиях CTP и CTPγS. Кроме того, мы также показываем, что часто белки ParB покидают ДНК из неспецифической области.

Все эти новые результаты были включены в новый раздел результатов, озаглавленный «Прямая визуализация распространения ParB из последовательностей parS», а также в новый рисунок 3 и рисунок 3 — дополнение к рисунку 1, что привело к изменению маркировки последующих рисунков.В обновленную рукопись также были включены новые разделы методов, касающиеся биотинилирования ParB, конъюгации с квантовыми точками и расчета констант диффузии.

2. Данные показывают, что несколько сайтов parS необходимы для конденсации ДНК в представленных экспериментах, в то время как в B. subtilis один сайт parS оказывается достаточным для всех функций, что потенциально подразумевает, что конденсация ДНК не важна. Авторы открыто признают это и предлагают два объяснения (стр. 10), включая различия в концентрации ParB и условиях раствора.Выводы рукописи будут значительно укреплены, если авторы смогут варьировать эти параметры и определять условия, которые могут позволить (ограниченную) конденсацию ДНК с одним сайтом parS.

Теперь мы рассмотрели вопрос о количестве последовательностей parS, необходимых для уплотнения, несколькими способами. Во-первых, мы изготовили субстраты с C-ловушкой, содержащие только 7 или 2 копии parS, и повторили эксперименты с C-ловушкой с этими новыми субстратами. По сути, мы воспроизвели те же результаты, что и с ДНК 39x parS, и наши эксперименты по диффузии проводились с использованием этих новых субстратов (см. Также выше).

Наши данные показывают прямую корреляцию между силами конденсации и количеством последовательностей parS в экспериментах МТ. Как отметил рецензент, мы наблюдаем, что минимальное количество parS требуется для наблюдения конденсации в экспериментах МТ. Мы объясняем это тем фактом, что эти эксперименты всегда проводятся при наличии тянущей силы, которой может быть достаточно для предотвращения конденсации, если сила конденсации мала. Чтобы проверить эту гипотезу, мы также провели эксперименты в отсутствие тянущих сил, используя метод привязанного движения частиц (TPM) и атомно-силовую микроскопию (AFM).

Сначала мы использовали TPM для определения среднеквадратичных отклонений гранулы, параметра, коррелирующего с длиной контура ДНК. Мы сделали подходящую для экспериментов с TPM молекулу ДНК размером ~ 1700 п.н., содержащую один parS. В присутствии CTP мы наблюдали сильное уменьшение RMS-экскурсий, согласующихся с конденсацией ДНК. Тот же эксперимент, проведенный без CTP или с зашифрованной ДНК parS, не уменьшил отклонения RMS. Эти эксперименты включены в новое приложение 1. к рисунку 6.

Кроме того, мы использовали АСМ для изображения кольцевых молекул ДНК, содержащих ноль или один сайт parS, инкубированных в различных экспериментальных условиях.В отсутствие CTP молекулы ДНК и белки ParB оказывались монодисперсными на поверхности слюды. В присутствии CTP и только при использовании субстрата ДНК single-parS мы наблюдали кластеризацию и конденсацию участков ДНК, предположительно участка parS. Эти эксперименты включены в новое приложение к рис. 6 2. Вместе эти эксперименты подтверждают, что взаимодействия ParB приводят к конденсации ДНК и что для конденсации ДНК достаточно одного parS.

К рукописи добавлен новый текст, объясняющий эти эксперименты.Также были добавлены дополнительные методы и рисунки.

3. Обратитесь к дополнительным комментариям в индивидуальных обзорах.

Мы учли дополнительные комментарии отдельных рецензентов ниже. Рецензент №1:

Это исследование исследует, как недавно обнаруженная активность CTPase бактериального ParB способствует разделению ParS-содержащих сестринских хромосом в системе ParABS. Используя визуализацию флуоресценции, авторы непосредственно визуализировали связывание ParB с ParS, а также диффузное распространение белка по ДНК.Кроме того, они систематически и всесторонне исследовали, при каких условиях была получена ParB-опосредованная конденсация ДНК, которая считается необходимой для сегрегации хромосом. Данные авторов убедительно показывают, что связывание CTP с помощью ParB стимулирует его ассоциацию с ParS и, что наиболее важно, способствует его диффузному распространению от ParS. Диффузионное распространение по контуру ДНК было продемонстрировано с помощью белковых барьеров. Это обеспечивает достаточное доказательство диффузии белка по контуру ДНК, хотя авт. Не достигли прямой визуализации диффузии одиночных комплексов ParB вдоль ДНК.Тестируя широкий диапазон условий (концентрация ParB, присутствие Mg ²⁺ , гидролизуемый и не-CTP, количество сайтов ParS), авторы продемонстрировали, что связывания CTP, а не гидолиза достаточно для ParB, чтобы способствовать конденсации ДНК. Два разных типа наблюдений вместе показывают, что CTP-обеспечиваемое диффузное распространение ParB из ParS управляет последующей конденсацией ДНК. Более того, эксперименты по наномеханической конденсации ДНК вместе с комбинированной прямой флуоресцентной визуализацией представляют собой полезное методологическое развитие для будущих исследований этой системы.В целом представленная работа является ясным и всесторонним исследованием, которое предоставляет прямые и недвусмысленные доказательства недавно предложенных моделей ParB-опосредованной конденсации ДНК и ее стимуляции с помощью ParS и CTP.

1) Учитывая потенциал используемой установки C-ловушки, было бы очень интересно непосредственно наблюдать одномерную диффузию отдельных комплексов ParB вдоль ДНК. Могли ли авторы с легкостью получить такие данные, а если нет, то что мешало наблюдению одиночных молекул? Знание о константе диффузии / коэффициенте трения потенциально может помочь понять, как свободно диффундирующие комплексы могут способствовать конденсации ДНК.

Мы полностью согласны с рецензентом, и фактически мы работали над этой целью, пока статья находилась на рецензировании. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

В свете этих новых данных диффузии становится ясно, что в экспериментах с МТ белки ParB присутствуют вокруг неспецифической области субстрата ДНК. Однако высокая сдерживающая сила предотвращает их межмолекулярные взаимодействия.Мы предполагаем, что уменьшение силы приводит к появлению дистальных сегментов ДНК, которые стабилизируются посредством взаимодействий ParB-ParB, что приводит к конденсации ДНК.

2) Предполагая, что комплексы ParB быстро диффундируют по ДНК, как авторы предполагают, что конденсации будут способствовать такие белки, у которых отсутствует какой-либо якорь (см. Также 1)? Может ли взаимодействие с другими комплексами ParB при образовании петли подавлять подвижность комплексов ParB? Пожалуйста, добавьте короткое обсуждение.

Наши данные подтверждают модель, в которой белки ParB диффундируют с сайтов parS.Это должно приводить к присутствию нескольких ParBs на неспецифическом участке ДНК, в то время как молекула удерживается силами, недопустимыми для конденсации (как мы видим в экспериментах с C-ловушкой, Рисунок 1 и Рисунок 2). Дальнейшее уменьшение силы (как мы делаем в экспериментах с МТ) сближает удаленные белки, что приводит к образованию петель, что в конечном итоге приводит к конденсации ДНК. Конечно, эта модель конденсации требует межмолекулярных взаимодействий, которые могут исходить от CTD или NTD ParB, но мы не видим необходимости в том, чтобы белки закреплялись на неспецифических сайтах.В конечном счете, моделирование может пролить свет на этот момент, но это выходит за рамки данной работы.

Мы добавили текст в обсуждение по этому поводу.

3) Авторы показывают, что связывание CTP, а не гидролиз необходимо для содействия диффузному распространению и конденсации ДНК. Таким образом, роль гидролиза CTP остается неясной. Я мог представить, что гидролиз может стимулировать высвобождение ParB из ДНК и, таким образом, потенциально силы деконденсации конденсированной ДНК.Авторы апробировали такой сценарий?

Наши новые эксперименты с C-ловушкой показывают, что часто ParB отделяется от неспецифической ДНК после диффузии с участков parS. Это согласуется с предыдущими моделями, предполагающими, что именно гидролиз CTP способствует высвобождению ParB из ДНК. Мы пытались измерить время жизни ParB на неспецифической ДНК в условиях CTP и CTPγS, но наши результаты не были окончательными, и это предмет для будущей работы. Измерение сил деконденсации в экспериментах МТ затруднено, поскольку мы обнаружили, что они зависят от уровня предыдущего уплотнения и потенциального неспецифического прикрепления конденсата к поверхности стекла.

4) Авторы также должны предоставить профиль флуоресценции в отсутствие CTP на Рисунке 1C, приложение 4.

Теперь мы добавили усредненный по времени профиль отсутствия CTP в приложении 4 к рисунку 1C.

Рецензент № 2:

В этой рукописи исследуется связывание и конденсация ДНК parS с помощью белка B. subtilis ParB в экспериментах с одной молекулой с использованием оптических ловушек и магнитного пинцета. Работа является продолжением недавнего открытия способности ParB связывать и гидролизовать CTP.Авторы показывают, что добавление CTP стимулирует связывание ParB с молекулами ДНК, несущими кластерные сайты parS, и способствует распространению ParB на соседнюю ДНК. Более того, показано, что связывание ParB приводит к конденсации ДНК с кластерными сайтами parS, опять же, активность, которая стимулируется CTP или негидролизуемым аналогом CTPgS.

В то время как в работе тщательно наблюдают и описывают активность ParB in vitro и сообщают о выводах, которые в значительной степени согласуются с недавними публикациями, потенциальная слабость исследования касается использования искусственно сгруппированных сайтов parS на тестовых субстратах ДНК и отсутствия аналогичной активности на других объектах. природные субстраты с одним участком parS, что в совокупности вызывает сомнения в физиологической значимости открытий.

сайтов parS широко рассредоточены в геноме B. subtilis (10 сайтов в ~ 1 мегабайтах), причем два ближайших сайта разделены примерно на 10 килобайт. Более того, одного сайта parS достаточно, чтобы поддерживать сегрегацию хромосом и способствовать нормальному формированию ParB фокуса. Ясно, что кластеризация сайтов parS не имеет решающего значения in vivo. Тем не менее, действия, обнаруженные в этой работе, по-видимому, строго зависят от кластеризации parS. Таким образом, неясно, действительно ли конденсация ДНК с помощью ParB, как здесь описано, происходит in vivo и имеет ли она отношение к функции ParB.

Чтобы решить проблему кластеризации parS, мы изготовили две новые подложки C-trap, содержащие 7 и 2 копии parS (новый рисунок 2, дополнение 1A, новый рисунок 3 и новый рисунок 3, приложение 1). По сути, мы получили те же результаты, что и с 39x parS, исключая эффект кластеризации parS. Эксперименты с QD-меченным ParB показали стабильное связывание с отдельными сайтами parS и позволили нам непосредственно наблюдать диффузию белков ParB вдоль неспецифической ДНК. Дальнейшие эксперименты с использованием метода TPM (новый рисунок 6, приложение 1) и AFM (новый рисунок 6, приложение 2) с субстратами с одним parS подтвердили CTP-зависимую конденсацию ДНК.Таким образом, все эти новые эксперименты показывают, что кластеризация parS не требуется для конденсации.

В родственном препринте (Taylor et al., 2021) сообщается о подобной конденсации ДНК с использованием плазмиды F ParB. Однако в этом случае кластерные сайты parS естественным образом обнаруживаются на соответствующей ДНК, плазмиде F. Таким образом, конденсация ДНК наблюдалась только с кластерными сайтами parS. Это следует обсудить и дополнительно изучить.

Мы наблюдали прямую корреляцию между силами конденсации и количеством последовательностей parS в экспериментах МТ.Мы также заметили, что минимальное количество parS требовалось для наблюдения конденсации в экспериментах МТ. Мы объясняем это тем фактом, что эти эксперименты всегда проводятся при наличии тянущей силы, которой может быть достаточно для предотвращения конденсации, если сила конденсации мала. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели эксперименты в отсутствие тянущих сил, используя метод привязанного движения частиц (TPM) и методы атомно-силовой микроскопии (AFM). провели эксперименты в отсутствие тянущих сил, используя метод привязанного движения частиц (TPM) и методы атомно-силовой микроскопии (AFM).

Сначала мы использовали метод TPM для определения среднеквадратичных отклонений бусинки, параметра, коррелирующего с длиной контура ДНК. Мы изготовили молекулу ДНК, подходящую для экспериментов с TPM, размером ~ 1700 п.н., содержащую один parS. В присутствии CTP мы наблюдали сильное уменьшение экскурсий RMS, согласующееся с конденсацией ДНК. Тот же эксперимент, проведенный без CTP или с зашифрованной ДНК parS, не уменьшил отклонения RMS. Эти эксперименты включены в новое приложение 1 к рисунку 6.

Кроме того, мы использовали АСМ для изображения кольцевых молекул ДНК с или без одного сайта parS, инкубированных в различных экспериментальных условиях. В отсутствие CTP молекулы ДНК и белки ParB оказывались монодисперсными на поверхности слюды. В присутствии CTP и только при использовании субстрата ДНК single-parS мы наблюдали кластеризацию и конденсацию вокруг области ДНК, предположительно области parS. Эти эксперименты включены в новое приложение 2 к рисунку 6.

Вместе эти эксперименты подтверждают, что взаимодействия ParB приводят к конденсации ДНК и что одного parS достаточно для конденсации ДНК.

К рукописи добавлен новый текст, объясняющий эти эксперименты. Также были добавлены дополнительные методы и рисунки.

Авторы утверждают, что они могут напрямую обнаруживать связывание ParB с parS («первая визуализация специфического связывания ParB с parS»). Однако их анализ не делает различий между ParB, связанным с parS, и 1D, диффундирующим ParB. Этот вопрос особенно важен, поскольку недавние исследования фактически показали, что ParB только временно связывает parS во время цикла гидролиза CTP (Jalal et al., 2020; Сох и др., 2019). Могут ли авторы различать привязку и смещение parS с помощью одного сайта parS и препятствий EcoRI?

Это важный момент, который также поднимали другие рецензенты. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

ParB-AF488 демонстрирует сильно сниженную активность CTPase (приложение к рисунку 1). Это связано с мутацией цистеина или с флуоресцентной меткой? Результаты необходимо подтвердить с использованием белка с другой меткой (другого цистеина или другого флуорофора в зависимости от того, что вызывает снижение активности).

Мы согласны с рецензентом в том, что ParB-AF488 имеет пониженную активность CTPase, о чем мы прозрачно сообщали в нашей первоначальной заявке. Это снижение не объясняется ошибками количественного определения белка из-за наличия метки, поскольку спектроскопические и гелевые методы оценки концентрации белка хорошо согласуются (данные не показаны). Может случиться так, что часть белка инактивирована в результате длительной процедуры мечения (рецензент сравнивает меченый белок с необработанным белком дикого типа, а не с ложно-меченым белком).

В любом случае очевидный эффект на связывание CTPase и ДНК менее чем в 2 раза (исходная статья и изображение ответа автора 1), а связывание ДНК стимулирует активность CTPase в той же степени, что и для дикого типа (исходная статья). Эти данные предполагают, что мечение вызывает минимальное нарушение активных центров фермента. Таким образом, мы со всем уважением не согласны с тем, что активность этого белка «серьезно снижается» из-за маркировки. Мы принимаем и признаем, что поведение нарушается диким типом, как это имеет место во многих исследованиях отдельных молекул с использованием флуоресцентно меченых белков.

Важно отметить, что это небольшое количественное изменение скорости оборота ОСАГО не влияет на наши выводы. Наша работа сосредоточена на больших и качественных эффектах CTP на поведение белка, и они согласуются во всех экспериментах, в которых используются препараты как меченых (C-ловушка), так и немеченых (MT, TPM, AFM). Во всех случаях мы контролируем эти CTP-зависимые эффекты, проводя эксперименты в отсутствие нуклеотидов или в присутствии негидролизуемых аналогов или CDP.

Репрезентативные TBM- и TBE-EMSA, оценивающие связывание

Сохраняется специфическая и неспецифическая ДНК-связывающая активность, подобная дикому типу. Обнаружение флуоресцентного белка в геле соответствует структуре нуклеопротеидных комплексов.

Рецензент № 3:

ParBs связываются с центромерным сайтом, называемым parS, с образованием больших конденсированных комплексов, в которых ParBs, как наблюдают, распространяются на многие bp от parS, но механизмы распространения являются предметом обсуждения. Настоящее исследование основано на недавних открытиях, что ParB связывают и гидролизуют CTP, и что CTP способствует распространению. Здесь авторы непосредственно визуализируют флуоресцентные ParB, связанные с parS на ДНК, которая растянута, потому что она привязана на обоих концах.Они исследуют конденсацию с помощью магнитного пинцета на ДНК, привязанной к одному концу и притягиваемой магнитом на другом конце. Они обнаружили, что CTP действительно способствует parS-специфическому связыванию и распространению ДНК, и эта активность требует CTP, но не гидролиза. Результаты расширяют их предыдущие опубликованные анализы в отсутствие CTP, в которых авторы наблюдали распространение, но оно не было специфичным для parS и требовало более высоких концентраций ParB. Их результаты повторяют многие свойства распространения, которые наблюдались in vivo, включая специфичность для parS и влияние препятствий.Результаты согласуются с моделью, предложенной Soh et al. (2019), в которых CTP блокирует ParB в качестве зажима вокруг ДНК, способствуя самоассоциации N-концевого домена, и что после зажима он скользит по ДНК от parS; то есть скольжение предлагается в качестве механизма растекания. Однако результаты также согласуются с распространением за счет кооперативного взаимодействия ParB с теми, которые связаны рядом с ними, поэтому эти данные не поддерживают прямое скольжение, исключая другие альтернативы. Поскольку это различие не разрешается текущими результатами, можно рассматривать эти результаты как подтверждающие.Однако эти результаты имеют важное значение. Как утверждают авторы, это первый случай, когда связывание молекулы ParB с линейной ДНК на и вокруг parS было непосредственно визуализировано в исследованиях отдельных молекул; то есть с разрешением для parS по сравнению с близко расположенными регионами. Возможность просматривать комплексы непосредственно в этом разрешении на ДНК непосредственно проверяет локализацию ParB / parS и влияние распространяющихся препятствий. Во-вторых, специфичность для parS (или ее отсутствие) долгое время была проблемой для исследования in vitro связывания ParB с parS в биофизических экспериментах.Также авт. Показывают, что скольжение по-прежнему предпочитает находиться близко к области parS (она не «свободна»), указывая тем самым, что латеральные (и, возможно, мостиковые) белок-белковые взаимодействия играют роль в сложной архитектуре.

1. Рисунок 2G: Подходящим контролем является тот же эксперимент без EcoRI, который должен быть включен. В противном случае мы вынуждены сравнивать разные субстраты ДНК с этим и с предыдущими рисунками.

Следуя предложению рецензента, мы провели контрольный эксперимент без мутанта EcoRI (изображение ответа автора 2).Как и ожидалось, блокировки не наблюдалось. Обратите внимание, что включение профиля на рис. 2G неуместно, потому что молекулы разные, с разной интенсивностью флуоресценции и ориентацией. Мы включили предложение в основной текст, указывающее, что этот результат не показан.

ParB распространяется в отсутствие препятствий EcoRI с использованием C-ловушки EcoRI 39x

2. Вверху страницы 7: «предполагает, что это происходит при скольжении из parS». Хотя авторы явно предпочитают модель скользящего зажима (как и я), их данные не касаются того, является ли скользящее или латеральное рекрутирование белок-белок ответственным за распространение в этих экспериментах. Ключевое различие состоит в том, были ли молекулы ParB, которые распространились на соседнюю ДНК, загружались по parS или просто рядом с другими ParB в том, что они называют «ближним распространением».Контрольно-пропускные пункты также подходят для скольжения, но другие модели также могут их приспособить.

Это важный момент, который также поднимали другие рецензенты. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

3. Страница 2 и в других местах: «Абсолютное требование для связывания CTP, но не для гидролиза». Авторы не тестировали CDP, хотя Soh et al. показали, что CDP действительно способствует сходной N-концевой самоассоциации, которая стимулируется CTP.Это важная часть модели; работает ли CDP или белок должен находиться в апо-форме, чтобы диссоциировать от ДНК. Авторы тестировали CDP? Если да, эти данные могут быть включены. Если нет, следует обсудить CDP.

Следуя предложению рецензента, мы провели эксперименты с C-ловушкой и MT с использованием CDP. Наши результаты показали связывание ParB с parS на уровнях, аналогичных условию отсутствия нуклеотидов (изображение ответа автора 3), и отсутствие диффузии из parS. Как и ожидалось, конденсации ДНК не наблюдали в условиях CDP (изображение ответа автора 3).Это подтверждает наш вывод, что именно связывание CTP, а не гидролиз усиливает связывание ParB с parS и способствует диффузии ParB из parS и конденсации.

(слева) Сканирование C-ловушки, показывающее связывание ParB с

(справа) Динамика MT, показывающая отсутствие конденсации в присутствии CDP и Mg ²⁺ .

Мы включили профиль интенсивности флуоресценции, соответствующий состоянию CDP, на рис. 2C. Мы также включили эксперимент MT, показывающий отсутствие конденсации, как новый рисунок 5C. Эти новые результаты описаны и прокомментированы в основном тексте.

4. Рис. 1-S1C: правые 3 столбца выглядят неправильно маркированными, потому что они идентичны 3 средним столбцам, как указано. Они с ОСАГО?

Спасибо, что указали на эту опечатку.В самом деле, он должен и теперь читает CTPγS.

5. Рисунок 1-S4: что такое время = 0? Включите возбуждение?

Да, время = 0 соответствует включению возбуждения. Мы включили это предложение в заголовок рисунка 1-S4D.

Рецензент № 4:

Francisco et al. исследовать роль CTP и гидролиза в связывании ParB с последовательностью parS и неспецифической ДНК на уровне одной молекулы. Используя оптический пинцет, они показывают специфическое связывание ParB с сайтами parS и демонстрируют, что этот процесс усиливается присутствием CTP или CTPγS.Они обнаружили, что белки ParB с более низкой плотностью также обнаруживаются в дистальной неспецифической ДНК в присутствии parS, и что распространение ParB ограничивается белковыми препятствиями. Кроме того, с помощью магнитного пинцета они показали, что молекулы ДНК, содержащие parS, конденсируются с помощью ParB при наномолярной концентрации белка, что требует связывания CTP, но не гидролиза. Эти находки показывают важность CTP-зависимого распространения ParB и влияют на понимание механизма образования мостиков и конденсации ДНК сетями ParB.

Основываясь на этих результатах, авт. Предлагают модель ParB-обеспечиваемой конденсации ДНК, которая требует одномерного скольжения ParB вдоль ДНК от сайтов parS. В целом эксперименты проводились тщательно и тщательно контролировались. В рукописи содержится критическая информация, которую можно усилить, решив следующие проблемы:

1. Наблюдали ли авторы диффузию изолированных фокусов ParB вдоль ДНК? Это станет убедительным доказательством предлагаемой модели диффузии / скольжения.

Это важный момент, который также поднимали другие рецензенты. Пожалуйста, смотрите наш подробный ответ на этот вопрос в разделе «Основные изменения», разработанном редактором.

2. На основе модели скользящего зажима, распространение и диффузия ParB приводят к конденсации ДНК за счет образования больших петель ДНК. Можно ли показать динамическое распространение ParB при сохранении того же количества ParB на ДНК? Например, могут ли авторы инкубировать ParB-содержащую ДНК в канале 4 (канал ParB) в определенное время для загрузки ParB на сайты parS, а затем переместить ее в буферный канал без свободного ParB, а также с CTP или CTPγS, где изображения получены с длительным интервалом времени, чтобы минимизировать фотообесцвечивание.Можно проанализировать интенсивность флуоресценции ParB во время процесса распространения. Если интенсивность остается постоянной в результате распространения в присутствии CTPγS, но значительно снижается в присутствии CTP, эти данные убедительно демонстрируют предложенный механизм распространения и зависимого от гидролиза диссоциации CTP.

Мы благодарим рецензента за эти предложения, подтверждающие распространение. Тем не менее, мы решили следовать альтернативной стратегии, основанной на прямой визуализации QD-меченного ParB.Как описано выше, эта стратегия сработала, и мы непосредственно визуализировали распространение ParB с сайтов parS.

3. На рисунке 2 авторы показывают, что распространение ParB может быть заблокировано EcoRI. Могут ли авторы показать, что EcoRI связан в позициях специфичности? Распространяющаяся блокировка белковыми препятствиями, показанная в экспериментах с оптическим пинцетом, потенциально указывает на то, что препятствия могут влиять на конденсацию ДНК. Могут ли авторы применить магнитный пинцет, чтобы показать влияние белковых барьеров на конденсацию ДНК in vitro?

Хорошо известно, что EcoRI имеет чрезвычайно высокое сродство и специфичность к своему сайту (Terry et al., 1983), и, поскольку у нас нет меченого мутанта EcoRI, наши эксперименты предполагают, что сайты заняты. Это одна из причин, по которой в наших экспериментах мы использовали несколько сайтов. Тем не менее, мы проверили влияние белковых барьеров на конденсацию в экспериментах с МТ. Мы обнаружили частичную концентрацию, совместимую с блокированием распространения ParB из parS (Рисунок 7, приложение 1).

Список литературы

Брейер А.М., Гроссман А.Д. 2007. Полногеномный анализ белка разделения хромосом и споруляции Spo0J (ParB) выявляет участки распространения и исходно-дистальные участки на хромосоме Bacillus subtilis . Mol Microbiol 64: 703–718. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2007.05690.x

Graham TG, Wang X, Song D, Etson CM, van Oijen AM, Rudner DZ, Loparo JJ. 2014. Распространение ParB требует образования мостиков ДНК. Genes Dev 28: 1228–1238. DOI: 10.1101 / gad.242206.114

Гильяс Б., Уолтер Дж. С., Рех Дж., Дэвид Дж., Валлисер Н. О., Палмери Дж., Матье-Демазьер С., Пармеджиани А., Буэ Дж. Ю., Ле Галль А., Нолльманн М. 2020. Разделение конденсатов жидкой фазы в бактериях под действием АТФ. Mol Cell 79: 293-303.e4. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.molcel.2020.06.034

Livny J, Yamaichi Y, Waldor MK. 2007. Распределение центромер-подобных сайтов parS у бактерий: выводы из сравнительной геномики. Дж. Бактериол 189: 8693–8703. DOI: 10.1128 / JB.01239-07

Терри Б.Дж., Джек В.Е., Рубин Р.А., Модрич П. 1983. Термодинамические параметры, регулирующие взаимодействие эндонуклеазы EcoRI со специфическими и неспецифическими последовательностями ДНК. J Biol Chem 258: 9820–9825.

CTP и parS координируют динамику комплекса разделения ParB и активацию ParA-ATPase для ParABS-опосредованного разделения ДНК

Существенных изменений:

1) Взаимодействие между ParBF и самим CTP (при наличии / отсутствии parSF) не получило особого внимания со стороны авторов. Насколько сильно ParBF связывается с CTP? Связывает ли ParBF CTP в отсутствие parSF? Насколько быстро ParBF гидролизует CTP в присутствии / в отсутствие parSF? Эта информация очень важна для полной оценки результатов в этой рукописи, особенно тех, где присутствуют все компоненты: ParAF, ParBF, ATPyS, CTP, parSF.(Некоторая первоначальная информация уже есть в Soh et al.2019, но это были предварительные наблюдения.)

Спасибо, что указали на эту проблему. У нас были предварительные данные об активности CTPase ParB _{F ​​}, но не было данных для публикации. Мы выполнили новый набор измерений CTPase в присутствии и в отсутствие parS _{F ​​} , чтобы оценить кажущееся CTP K _M и k _cat , которые теперь представлены на рисунке 5 — дополнение к рисунку 2 и описан на стр. 15, строки 295–304 (номера строк предназначены для просмотра макета печати без отображения разметки).

Мы также очень заинтересованы в характеристике активности CTPase ParB _{F ​​} в присутствии ParA _{F ​​} и других кофакторов. Однако мы хотим подойти к этой теме систематически, если возможно, включая изучение активности ParB CTPase в присутствии гидролиза АТФ с помощью ParA. Однако, поскольку g- ³² P-CTP недоступен (и удаление загрязняющего CDP из a- ³² P-CTP непросто по сравнению с удалением π из g- ³² P-ATP, как это делается для наш субстрат для анализа АТФазы), в настоящее время мы изучаем доступные нам технические возможности.Завершение этого проекта в текущих рабочих условиях потребует значительного времени, а включение этого исследования не только вызовет длительную задержку публикации текущей рукописи, но и сделает ее чрезмерно долгой. Поэтому мы планируем провести отдельное комплексное исследование, которое будет опубликовано в следующем документе.

2) Согласно представленной модели, стехиометрия взаимодействий ParA-ParB в присутствии CTP и / или parS может быть изменена путем обеспечения дополнительной гибкости связи между N-концевым ParA-взаимодействующим пептидом в ParB и ParB CTP. домен.Если действительно стехиометрия является критической, то ожидается, что такие мутанты ParB будут иметь дефекты разделения плазмиды. Если этот эксперимент может быть выполнен, было бы важно показать, как он будет иметь прямое отношение к наиболее важному открытию в этой рукописи, то есть стехиометрии взаимодействия ParA-B +/- CTP.

Спасибо, что указали на этот важный тест представленной здесь модели. Мы действительно рассматривали возможность создания таких искусственных мутантов, чтобы подтвердить эту гипотезу.

Однако N-концевые области плазмид ParB, такие как F или P1, длиннее хромосомных ParB, и граница между доменом взаимодействия ParA и доменом CTPase остается несколько неоднозначной, что требует проведения нескольких предварительных экспериментов, прежде чем мы сможем завершить дизайн. мутантного белка. Поскольку наши возможности по проведению экспериментов все еще ограничены, включение этих экспериментов в текущую рукопись вызовет существенную задержку публикации. В исправленную рукопись мы включили прогнозы для таких мутантов и представили обзор наших будущих планов в отношении этих мутантов в разделе «Обсуждение» (стр. 27, строки 535-540).

Другие серьезные проблемы, на которые стоит обратить внимание, если это возможно:

3) Работа, описанная в этой рукописи, основана на привлечении ParA-ATPgS к ДНК, что очевидно неэффективно по сравнению с ParA-ATP (Vecchiarelli, 2013?). Этот факт (если это действительно так) необходимо более четко указать в тексте, в настоящее время он подразумевается лишь косвенно. Есть ли способ проверить выбранные результаты в более физиологических условиях с использованием АТФ (например, с мутантами активного сайта ParA)?

ParA-ATPgS действительно нарушен при превращении димера, не связывающего ДНК, в димер, связывающий ДНК (Vecchiarelli 2010, 2013), и мы использовали это свойство в наших интересах в этом исследовании, чтобы гарантировать, что белки, связанные с нсДНК, представляют собой белки, образующие комплекс.Мы добавили пояснения по этому поводу в исправленную рукопись (стр. 7, строки 133–136).

Однако разница в свойстве связывания нсДНК ParA-ATPgS и ParA-ATP кажется незначительной. Например, при более высоких концентрациях ParA ParA-ATPgS связывает ДНК более эффективно без ParB. Возможно, был обнаружен какой-нибудь мутант активного сайта АТФазы, который позволил бы нам проводить эксперименты в присутствии АТФ. Однако на сегодняшний день мы не нашли мутанта, который делает связывание ДНК зависимым от ParB в присутствии АТФ.Использование мутанта ParA, который связывает нсДНК в присутствии АТФ без ParB, потребует нового экспериментального протокола, который еще предстоит установить. Таким образом, мы будем ждать следующего этапа проекта, чтобы изучить возможное использование АТФаза-дефектного ParA в характеристике комплекса ParA-ParB.

4) Интересны результаты экспериментов по конденсации ДНК ParB. Могли ли авторы оценить / определить (локальную) концентрацию ParB, необходимую для уплотнения ДНК? Сходным образом было бы полезно исследовать, действительно ли происходит прогрессирующая конденсация ДНК путем последовательного рекрутирования димеров ParB на сайт parS (Рисунок 6A).Остановится ли уплотнение ДНК при блокировании parS?

Спасибо за указание на это важное ограничение в нашем текущем эксперименте. В этом исследовании магнитный пинцет не был оснащен функцией флуоресцентной визуализации, поэтому мы не смогли количественно оценить распространение ParB _{F ​​} вокруг участка parS _{F ​​} во время конденсации ДНК. Следовательно, мы не можем напрямую оценить количество молекул ParB _{F ​​}, участвующих в конденсации ДНК.Однако в соответствии с недавно опубликованными данными других групп, касающихся хромосомных ParB, мы полагаем, что наши результаты согласуются с представлением о том, что плотно конденсированное состояние ДНК, содержащей parS _{F ​​} , в наших экспериментах содержит большое количество ParB _{. Молекулы F} . Наши результаты, а также опубликованные работы других групп предсказывают, что блокирование parS остановит уплотнение ДНК. Однако это не было проверено напрямую. В исправленную рукопись мы добавили заявление, разъясняющее эти моменты в Обсуждении на странице 23, строки 448-452.В настоящее время мы готовим экспериментальный план для следующего этапа нашего исследования, чтобы ответить на ряд оставшихся без ответа вопросов, включая вопросы, поднятые здесь рецензентами.

5) На основании экспериментов с магнитным пинцетом (МП) Taylor et al. предположил, что «Наши результаты показывают, что ДНК-конденсация вызывается взаимодействиями ParBF-ParBF, образующими петлевые мосты ДНК, не требуя других белковых факторов». До открытия CTP преобладала точка зрения на то, что ParB-ParB образует опосредованные белком мостики, которые конденсируют ДНК.Теперь, когда мы знаем, что ParB, скорее всего, образует скользящий зажим на ДНК, существует вероятность того, что скольжение вызывает сверхспирализацию ДНК, сродни тому, как RNAP / PNCA работает на ДНК, и что суперспирализация ДНК вызывает уменьшение удлинения ДНК в эксперименте с МТ. Может Тейлор и др. различать две возможности? Может быть, повторить эксперименты МТ с разорванной ДНК, чтобы рассеять накопившуюся суперспирализацию?

Рецензент предлагает интересный момент, касающийся возможности уплотнения, частично вызванного сверхспирализацией ДНК.Чтобы обратиться к этой интересной возможности, мы включили сравнение уплотнения разорванной ДНК и суперспиральной ДНК с помощью ParB. Мы могли отличить разорванную ДНК от «спиральной» (скрученной во вращении) ДНК, скручивая отдельные молекулы ДНК в магнитном пинцете до связывания ParB _{F ​​}. Скручивание интактной спиральной ДНК приводит к образованию плектонем, о чем свидетельствует уменьшение удлинения ДНК, тогда как удлинение разорванной или скрученной ДНК нечувствительно к скручиванию.Мы обнаружили, что конденсация с помощью ParB была сравнима как для молекул ДНК с ограниченным вращением, так и для неограниченных молекул, предполагая, что конденсация ДНК с помощью ParB маловероятна из-за «эффективной генерации суперспирали с помощью ParB, движущегося вдоль ДНК». В отредактированной рукописи мы добавили этот результат как рисунок 6 — приложение к рисунку 2 и добавили текст, объясняющий это, на стр. 19, строки 355-358.

6) Связывает ли ParBF CDP в присутствии / отсутствии parSF? Эксперименты в этой рукописи предполагают, что это так (Рисунок 5F, Рисунок 6B-C), но другие хромосомные ParBs, как известно, не связываются с CDP.

Наши более ранние результаты показали, что CDP (2 мМ), вероятно, связывает ParB _{F ​​} в условиях нашей реакции. Однако отличие от результатов экспериментов без С-нуклеотидов было относительно незначительным. В ответ на комментарий рецензента мы попытались изучить связывание CDP с ParB _{F ​​} с помощью биофизических методов, а также попытались измерить кажущееся K _i CDP на предмет активности CTPase. Однако мы столкнулись с техническими трудностями, которые, как мы в конечном итоге определили, возникли из-за того, что использованный нами препарат CDP был загрязнен небольшим, но значительным количеством (~ 2-3%) соединения, которое действует как субстрат для ParB _{F ​​}, высвобождение Pi (скорее всего, это ОСАГО, но мы еще не определили напрямую личность загрязнения).Мы исследовали несколько партий CDP, полученных из нескольких источников, но не смогли идентифицировать препарат CDP, свободный от этого загрязнения. Нам не удалось найти коммерческий источник CDP более высокого качества, и очистка CDP в текущих лабораторных условиях приведет к дальнейшим существенным задержкам. Вдобавок, даже если нам удастся получить CDP, по существу, свободный от этого загрязнителя, некоторые из описанных в статье экспериментов с CDP в настоящее время невозможно своевременно повторить; первый автор, проводивший эти эксперименты, был вынужден покинуть страну в прошлом году и не сможет вернуться, чтобы повторить эксперименты, а прибор, использованный для исследования, в настоящее время подвергается реконфигурации для устранения неисправности системы лазерного освещения.

К счастью, в данной статье эксперименты с CDP были выполнены в основном как контрольные эксперименты для сравнения с результатами экспериментов с CTP, и влияние относительно низкой концентрации загрязнителя, если таковое имеется, представляется относительно незначительным. Другими словами, результаты экспериментов с CDP явно отличались от результатов в присутствии CTP, но не сильно отличались от результатов без C-нуклеотидов, что указывает на то, что либо CDP не связывает в значительной степени ParB _{F ​​} в используемых условиях, либо в случае связывания это, вероятно, не существенно изменяет поведение ParB _{F ​​} в отношении свойств, исследованных в большинстве экспериментов.Таким образом, вышеуказанный вывод не оказал существенного влияния на общие выводы данной статьи. Мы описали это открытие на стр. 16, строки 305–312 (и рис. 5 — дополнение к рисунку 2D). Во избежание путаницы мы также исключили небольшую часть данных (Рисунок 5B, Рисунок 5F — данные CDP в исходной рукописи), интерпретация которых неоднозначна в свете этого открытия. Мы отредактировали рукопись в ряде дополнительных мест, чтобы отразить это новое открытие, например, стр. 19, строки 362–364.

Мы отмечаем, что Osorio-Valeriano et al., Показали, что ParB _MX связывает CDP с низким сродством, но в их измерениях также использовался CDP, поставляемый Sigma с тем же номером по каталогу, который использовался в наших экспериментах, который, как было обнаружено, содержит загрязняющее вещество. . Следовательно, опубликованный K _D для CDP может быть неточным.

Мы благодарим рецензентов за комментарий, который побудил нас изучить взаимодействие CDP-ParB и позволил найти проблему, о которой мы не знали.Мы планируем очистку нуклеотидов, когда нам станет доступно необходимое оборудование.

7) Другой интересной областью является то, как на активность ParBF CTPase влияет присутствие ParA, и это само по себе имеет важные последствия для модели «диффузионно-трещотка». Тейлор и др. возможно, захочется исследовать это в будущем, но, может быть, авторы могут упомянуть об этом в Обсуждении?

Как упоминалось в ответе на основной комментарий 1), мы очень заинтересованы в расширении нашего исследования, чтобы ответить на вопросы, предложенные здесь.В идеале было бы неплохо провести чувствительный и нуклеотид-специфический анализ CTPase в присутствии активности ATPase в реакции. Если это окажется трудным, мы можем начать исследование в условиях, когда гидролиз АТФ не происходит, с использованием ATPgS или мутантного ParA.

Для текущей рукописи, как было предложено, мы упомянули этот момент в Обсуждении как один из нескольких оставшихся вопросов, которые должны быть рассмотрены в будущем исследовании на стр. 27, строки 544-545.

Разделка

Из-за их функциональной полярности и удлиненной морфологии, основанный на микротрубочках транспорт белков и органелл имеет решающее значение для нормальной функции нейронов. Протеасома необходима во всем нейроне для строго регулируемой деградации широкого набора белковых мишеней, функции которых лежат в основе ключевых физиологических реакций, включая синаптическую пластичность и дегенерацию аксонов.Молекулярно взаимосвязь между транспортом протеасом и транспортом мишеней протеасом неясна. Моторный комплекс динеин необходим для основанной на микротрубочках подвижности многочисленных белков и органелл в нейронах. Это исследование демонстрирует, что транспорт протеасом в нейроне с помощью микротрубочек использует особую легкую цепь динеина по сравнению с синаптическими белками. Живое изображение протеасом и белков синаптических везикул в аксонах и синапсах обнаруживает, что эти грузы перемещаются независимо и что протеасомы демонстрируют значительно сниженные скорости ретроградного транспорта по сравнению с белками синаптических везикул.Генетический и биохимический анализ показывает, что гомолог LC8 легкой цепи динеина, разрезанный на динеин, у дрозофилы связывает протеасомы и функционирует специфически во время их транспортировки. Эти данные подтверждают модель, согласно которой функция Cut-up определяет опосредованный динеином транспорт нейрональных протеасом (Kreko-Pierce, 2017).

Протеасомы представляют собой большие белковые комплексы, ответственные за деградацию нормальных короткоживущих убиквитилированных белков, а также мутантных, неправильно свернутых или поврежденных белков.Все клетки нуждаются в регулируемой деградации белка; однако нервные клетки представляют особый интерес из-за их сложной компартментализации и необходимости деградации белков для нормальной функции нейронов. Кроме того, большое количество неврологических расстройств характеризуется скоплением белковых агрегатов, что позволяет предположить, что нарушение деградации белка является важной этиологией многих нейродегенеративных заболеваний. Поскольку деградация белка в нейронах происходит в короткие сроки и в высокой степени специфична для компартментов, нейроны должны обладать молекулярными механизмами, которые могут точно позиционировать протеасомы вблизи того места, где они однозначно необходимы, а также поддерживать физическое разделение между протеасомами и нейронными мишенями для сохранения эффективности регулируемых белковый оборот (Kreko-Pierce, 2017).

Многочисленные исследования продемонстрировали важную физиологическую потребность протеасомной активности во многих компартментах нейрона. Пресинаптическая протеасомно-зависимая деградация белка имеет решающее значение для образования синапсов, синаптической эффективности и высвобождения нейротрансмиттеров. Постсинаптически протеасомы участвуют в регуляции нескольких форм синаптической пластичности, включая долгосрочную потенциацию (LTP), долгосрочное облегчение (LTF) и долгосрочную депрессию (LTD).Более того, острая деполяризация нейронов вызывает глобальное изменение убиквитилированных белков активной зоны в синапсе, поддерживая роль протеасом в быстром обороте белков в ответ на активность нейронов. В совокупности эти данные предполагают, что протеасомы функционируют локально в пре- и постсинаптических сайтах, где они действуют как важные модуляторы синаптической структуры, функции и пластичности (Kreko-Pierce, 2017).

Помимо синаптических компартментов, есть доказательства того, что функция протеасом также играет важную роль в росте, развитии и регенерации аксонов.Недавняя работа по развитию нейронов показала, что изменения в ретроградном аксональном транспорте протеасом являются критическими во время спецификации и роста аксона. Исследования на Drosophila предоставляют доказательства того, что дегенерация аксонов, которая происходит во время обрезки в процессе развития или в ответ на травму, требует убиквитин-протеасомной системы (UPS). В соответствии с этими наблюдениями на мухах, ингибирование UPS на моделях грызунов задерживает отмирание аксонов, наблюдаемое во время дегенерации аксонов Валлера, демонстрируя роль деградации белка во время запрограммированной дегенерации аксонов у млекопитающих.Эти данные предоставляют убедительные доказательства эволюционно законсервированной потребности в активности протеасом в аксоне как в нормальных, так и в патологических условиях (Kreko-Pierce, 2017).

Несмотря на критические компартмент-специфические требования для функции протеасом в нейронах, мало что известно о молекулярных механизмах, которые управляют транспортом протеасом и их мишенями в нейронах. Транспортировка органелл и транспортных везикул во всех клетках преимущественно опосредуется транспортными механизмами на основе микротрубочек (МТ) с использованием двух различных молекулярных моторных белков, кинезинов и цитоплазматических динеинов.Кинезины в основном опосредуют транспорт, направленный на плюс-конец MT, включая антероградный транспорт аксонов в нейронах. В геноме человека 45 генов кодируют суперсемейство кинезинов, поддерживая генетическую основу большого разнообразия транспортных событий, связанных с грузом, на основе кинезина. Цитоплазматический динеин опосредует транспорт MT, направленный на минус-конец, включая ретроградный транспорт аксонов. Однако, в отличие от кинезинового мотора, цитоплазматический динеин кодируется относительно небольшим количеством генов, что позволяет предположить, что груз-специфичность моторного комплекса динеина достигается за счет гетерогенности субъединиц динеинового комплекса и различных связанных с динеином дополнительных белков.Легкие цепи динеина LC8 (DYNLL1 и DYNLL2 у млекопитающих) были предложены в качестве карго-адаптеров, потенциально обеспечивающих специфичность для направленного на минус-конец транспорта везикул и органелл MT. Это мнение было подтверждено исследованиями, в которых было обнаружено, что LC8 одновременно ассоциируется с динеиновым мотором и с рядом грузов, которые подвергаются МТ-опосредованному транспорту (Kreko-Pierce, 2017).

В этом исследовании использовалось сочетание генетики, биохимии и визуализации in vivo для сравнения основанного на МТ транспорта протеасом и синаптических белков в двигательных нейронах дрозофилы.Эти анализы показали, что протеасомы используют транспорт аксонов на основе MT в аксонах и что транспорт аксонов качественно подобен транспорту синаптических белков. Однако количественный анализ транспорта протеасом выявляет значительные различия в ретроградном транспорте протеасом по сравнению с транспортом синаптических белков. Эти данные указывают на потенциальные молекулярные различия в моторных комплексах динеина, используемых этими двумя разными типами грузов. В поддержку этой идеи прямой генетический скрининг идентифицировал ген cut up (ctp) , гомолог LC8 у дрозофилы, как необходимый для аксонального транспорта протеасом, но не синаптических белков.Эти результаты предоставляют молекулярные доказательства того, что протеасомы и их мишени используют специфические моторные компоненты динеина во время транспорта на основе МТ в нейронах (Kreko-Pierce, 2017).

Это исследование использовало покадровую визуализацию флуоресценции и отслеживание отдельных частиц в личинках дрозофилы третьего возраста для изучения движения протеасом в двигательных нейронах. Данные демонстрируют, что протеасомы используют быстрый транспорт аксонов на основе MT для движения в двигательных нейронах дрозофилы, в том числе в пресинаптическом нервном окончании.Количественный анализ протеасомного транспорта в аксонах мотонейронов показал, что скорость ретроградного транспорта протеасом значительно ниже скорости антероградного транспорта. Это похоже на то, что наблюдалось при разработке культур гиппокампа, полученных из мозга мышей, что подтверждает идею консервативных транспортных механизмов. Кроме того, было обнаружено, что значения ретроградной скорости и длины пробега протеасом значительно меньше, чем у белков синаптических везикул, и что мутации в гене Klc оказали гораздо более сильное влияние на скорости ретроградного транспорта синаптобревина, чем на протеасомы. .Наконец, генетический анализ протеасомного транспорта показал, что у дрозофилы гомолог легкой цепи динеина LC8 млекопитающих, cut up (ctp) , необходим для ретроградного аксонального транспорта протеасом, но незаменим для ретроградного аксонального транспорта белков синаптических везикул. Эти анализы убедительно подтверждают модель, согласно которой протеасомы используют моторный комплекс динеина для транспорта, отличный от того, который используется другими синаптическими грузами. Интересно отметить, что синаптотагмин был идентифицирован как в протеомных исследованиях протеасомозависимой деградации белка, так и обнаружен в polyQ-индуцированных агрегатах белка.Эти данные подтверждают идею о том, что синаптотагмин, вероятно, расщепляется протеасомой, возможно, в синапсе. Учитывая физиологическое значение изменений в количестве ключевых синаптических молекул, таких как синаптотагмин, возможно, неудивительно, что протеасома и ее синаптические мишени используют разные транспортные механизмы. Можно было бы предсказать, что такое расположение будет защищать от непреднамеренных взаимодействий между ключевыми субстратами и протеасомами, сохраняя физиологическую эффективность регулируемых изменений в содержании белка (Kreko-Pierce, 2017).

Модель, согласно которой протеасомы и синаптические белки передаются независимо, по-видимому, противоречит данным недавнего исследования аксонального транспорта протеасом из культивируемых нейронов гиппокампа, которые предполагают, что протеасомы совместно транспортируются с различными мембранно-связанными грузами, включая синаптические пузырьки. белок синаптофизин. Это исследование специально рассматривало эту возможность путем одновременной коэкспрессии протеасом и синаптобревина в одном двигательном нейроне и анализа транспорта.Эти анализы совместного транспорта показали, что только 8% транспортных везикул синаптобревина совместно транспортируются с протеасомами, несмотря на сравнительно большое количество протеасомных частиц. Также было обнаружено, что в настоящем исследовании большая часть протеасом (~ 65%) движется, тогда как в другом исследовании сообщается об относительно небольшой популяции мобильных протеасом (~ 20%), причем большинство частиц демонстрируют беспорядочное обратное движение. (~ 80%). Более того, скорости ретроградного и антероградного транспорта протеасом, о которых сообщалось ранее, намного ниже, чем то, что наблюдалось в текущем исследовании.Следует отметить, что скорости, которые сообщаются как для антероградного, так и для ретроградного транспорта протеасом, согласуются со скоростями протеасом, наблюдаемыми в культивируемых нейронах гиппокампа во время дифференцировки аксонов. Эти несоответствия между исследованиями могут отражать различия, связанные с разными типами нейронных клеток или экспрессией репортера, или различиями между моделью in situ и культивированными первичными нейронами (Kreko-Pierce, 2017).

Цитоплазматический динеин — это мультисубъединичный моторный белок, ответственный за транспорт широкого диапазона грузов на основе МТ.Текущие данные предполагают, что Ctp Drosophila DLC может определять аксональный транспорт отдельных грузов. В соответствии с этой ролью, семейство DLCs LC8 (DYNLL1 и DYNLL2) млекопитающих, как было показано, одновременно связано с мотором динеина и рядом грузовых белков, включая компоненты активной зоны и белки, участвующие в локализации мРНК во время эмбриогенеза. Важно отметить, что мутации, которые нарушают взаимодействие этих белков с LC8, как было показано, нарушают их динеин-опосредованный транспорт MT, обеспечивая связь между LC8-связывающими партнерами и MT-зависимым переносом.Помимо демонстрации того, что ctp был необходим для нормального аксонального транспорта протеасом, представлены биохимические доказательства того, что Ctp физически взаимодействует с 20S и 19S субъединицами протеасом. Из этих исследований коиммунопреципитации неясно, связывается ли Ctp напрямую с этими специфическими субъединицами или, возможно, с какой-то другой субъединицей протеасомы. Структурные исследования показали, что большое количество различных грузов связывается с одной и той же бороздой в димере LC8 / Ctp и в некоторых случаях может либо конкурировать, либо способствовать связыванию с другими грузами, включая промежуточную цепь динеина.На основании текущих данных можно было бы предсказать, что связывание протеасомы 26S с Ctp будет способствовать ассоциации Ctp с промежуточной цепью динеина и облегчать динеин-зависимый транспорт. Ни синаптобревин, ни синаптотагмин не обладают такой активностью (Kreko-Pierce, 2017).

Помимо обеспечения специфичности груза, результаты также предполагают, что Ctp может влиять на процессивность динеинового мотора. Во-первых, было замечено, что протеасомы имеют более медленную ретроградную скорость транспорта, чем синаптобревин.Кроме того, ретроградные скорости и длина пробега протеасомного транспорта снижены, но не отсутствуют у мутантов ctp . Эти результаты предполагают, что ассоциация Ctp с мотором динеина изменяет биохимическую функцию результирующего моторного комплекса. В настоящее время мало что известно о том, как DLC участвуют в двигательной активности какой-либо системы. Предыдущие исследования продемонстрировали, что процессивность и активность динеинового мотора могут быть изменены посредством взаимодействий с различными регуляторными белками.Например, было показано, что динактиновый комплекс значительно увеличивает процессивность динеина, аналогично тому, что показано для ctp . Интересно, что несколько недавних исследований показывают, что для нормального взаимодействия между динеином и динактиновым комплексом необходима легкая цепь динеина LC8 (Jie, 2015; Stuchell-Brereton, 2011). Кроме того, мутации, которые нарушают функцию Dyn2 (дрожжевой гомолог LC8), также нарушают рекрутирование динактинового комплекса в моторный комплекс динеина (Stuchell-Brereton et al., 2011). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, изменяет ли Ctp процессивность протеасом из-за рекрутирования динактинового комплекса (Kreko-Pierce, 2017).

Исследования с использованием фармакологического ингибирования активности протеасом показали, что ингибирование протеасом приводит к быстрому увеличению функции синапсов, включая высвобождение нейротрансмиттера, что позволяет предположить, что протеасомы локализуются рядом с местом высвобождения нейротрансмиттера. Несмотря на доказательства, подтверждающие присутствие протеасом в пресинаптическом нервном окончании, прямые доказательства этого отсутствуют.Это исследование является первым, которое визуализирует и изучает перемещение протеасом в пресинаптическом нервном окончании. Более того, согласованность в динамике транспорта между аксоном и синапсом, совместная локализация с Futsch и отсутствие движения у мутантов ctp подтверждают идею о том, что синаптический транспорт протеасомы основан на MT. Более того, анализ морфологии синапсов у мутантов ctp демонстрирует, что протеасомы необходимы внутри NMJ для нормального роста синапсов во время развития личинок.Недавние исследования, направленные на изучение постсинаптических протеасом, подтвердили, что протеасомы претерпевают динамические изменения в своей субклеточной локализации в ответ на деполяризацию, указывая тем самым на роль транспорта протеасом во время синаптической пластичности. Будет важно исследовать, влияют ли мутации ctp на синаптическую пластичность в NMJ Drosophila (Kreko-Pierce, 2017).

Интересно, что это исследование также обнаружило, что поведение протеасом в синапсах имеет некоторые важные отличия от движения аксонов.Между этими двумя нейрональными компартментами наблюдалась существенная разница в количестве стационарных частиц, при этом количество стационарных протеасом в синапсе увеличивалось на ~ 400%. Кроме того, было обнаружено, что синаптические протеасомы перемещаются в среднем медленнее, чем протеасомы в аксонах. Подобное изменение в перемещении между аксоном и нервным окончанием также наблюдалось для белков нейрексина (Nrxn), которые также медленнее транспортируются в синапсе по сравнению с аксоном.Комбинация этих изменений в поведении по трафику способствует более длительному пребыванию отдельной протеасомы в синапсе по сравнению с аксоном. Распределение стационарных протеасом по всему NMJ может способствовать локальной деградации синаптических белков внутри бутона. Такое поведение контрастирует с исследованиями транспорта содержащих нейропептиды плотных ядерных везикул (DCV) внутри NMJ, которые имеют несколько стационарных везикул и используют модель непрерывного транспорта в синапсах, обеспечивающую непрерывный источник DCV.Эти различия указывают на то, что транспорт на основе MT внутри синапса приспособлен к конкретному грузу и их соответствующим функциям (Kreko-Pierce, 2017).