Лада ч рей: LADA XRAY кроссовер — Официальный сайт LADA

LADA XRAY кроссовер — Официальный сайт LADA

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

LADA XRAY | официальный дилер Лада Х Рей (Икс Рей) в Санкт-Петербурге

Новый LADA XRAY – компактный кроссовер, обеспечивающий максимальный комфорт от вождения, высокий уровень безопасности и уверенность при маневрировании. Он адаптирован к любым дорожным условиям и суровому климату. Концепцию модели нового поколения полностью отражает её название: «X» – кроссовер, «R» – отдых, «A» – активность, «Y» – молодость.

Модельный ряд LADA XRAY 2020-2021 года представлен базовой моделью и версией Cross с расширенными возможностями. Каждая модификация кроссовера создана для активного ритма жизни, для смелых и решительных людей, для покорения бескрайних просторов нашей страны.

Официальный дилер «ЛАДА-ЦЕНТР» предоставляет возможность купить автомобили XRAY в кредит, в лизинг и по системе «трейд-ин» на максимально выгодных условиях. Кроме того, мы осуществляем техническое и сервисное обслуживание, предлагаем индивидуальные программы кредитования и страхования, скидки и подарки в рамках действующих акций, а также широкий ассортимент оригинальных аксессуаров и дополнительного оборудования.

Записаться на тест-драйв кроссовера, уточнить варианты комплектации и цены на LADA XRAY 2020-2021 года в Санкт-Петербурге в наличии или задать любой другой интересующий вопрос можно, позвонив специалистам отдела продаж по многоканальному телефону или лично посетив один из наших дилерских центров.

XRAY в наличии
Спецпредложения

Салонов в России

Положительных отзывов

Авто в наличии

комплектации и цены от официального дилера

Колёсная база

2592

Размер колёс

215/50/R17

Ширина задней колеи

1546

Ширина передней колеи

1503

Объем багажника мин/макс, л

361/1207

Объём топливного бака, л

50

Полная масса, кг

1650

Снаряженная масса, кг

1295

Количество передач

5

Коробка передач

механика

вариатор

Тип привода

передний

Подвеска и тормоза

Задние тормоза

дисковые

Передние тормоза

дисковые вентилируемые

Тип задней подвески

полунезависимая, пружинная

полунезависимая, торсионная

Тип передней подвески

независимая, пружинная

Эксплуатационные показатели

Максимальная скорость, км/ч

180

162

Марка топлива

АИ-92

Разгон до 100 км/ч, с

10. 9

12.8

Расход топлива, л город

Расход топлива, л город/смешанный

Расход топлива, л город/трасса/смешанный

9. 7/6.3/7.5

Расход топлива, л смешанный

7.3

Диаметр цилиндра и ход поршня, мм

82 × 84

78 × 83. 5

Количество цилиндров

4

Максимальная мощность, л.с./кВт при об/мин

122 / 90 при 6050

113 / 83 при 5500

Максимальный крутящий момент, Н*м при об/мин

170 при 3700

152 при 4000

Объем двигателя, см³

1774

1598

Расположение двигателя

переднее, поперечное

Расположение цилиндров

рядное

Степень сжатия

10. 5

10.7

Тип двигателя

Тип наддува

нет

Название рейтинга

Оценка безопасности

Аккумуляторная батарея

Запас хода на электричестве, км

Lada X-RAY — автонастрой

С 2012 год поклонники отечественного автопрома ожидают выхода новой модели производства АвтоВАЗ – Лады Х-Рей. И недаром, ведь Ладу ХРей можно назвать одним из самых успешных дебютантов АвтоВАЗа – после того, как показ модели буквально «взрорвал» автомобильный мир, концепт стал новым лицом стилистики отечественного автопроизводителя. Так что же это за автомобиль? Давайте разберемся поподробнее. Лада Х-Рей характеристики, фото и цены вы сможете найти в этой статье.

На первый взгляд может показаться, что Lada ХРей – это внедорожник или кроссовер, но такими терминами это авто не позиционируется даже инженерами АвтоВАЗа. По мнению представителей компании, Лада Х-Рей – это, так сказать, обычный «высокий хэтчбек». Соответственно, транспортное средство теперь занимает собственную своеобразную нишу.

Что касается внешнего вида, то как вы сами можете посмотреть на фото, новая Х-Рей смотрится очень современно и привлекательно. Передняя часть транспортного средства выполнена в так называемом X-стиле, а хромические элементы только подчеркивают великолепный дизайн авто. На дверях Лада Х-Рей вы можете увидеть X-образные выштамповки. Благодаря низким обвесам и покатой крыше, а также тому, что лобовое стекло машины достаточно наклонено, авто еще более уверенно и динамично управляется на дороге.

В целом же новая Лада Х-Рей своим внешним видом значительно отличается от того образца, который был представлен публике в 2014 году. Модель двухгодичной давности была трехдверной, а раздутые формы и прочие стильные элементы кузова только подчеркивали уверенность и мощь авто.

Однако предсерийная модель имеет определенные изменения. В частности, оптика в ней теперь не такая заточенная, больше округлая. Решетка радиатора стала чуть больше по своим размерам, а интерфейс капота был незначительно изменен. Контур переднего бампера остался таким же, однако снизу появилась так называемая губа. По утверждению разработчиков, она способствует оптимизации показателей аэродинамики. Также следует отметить, что теперь бампер оборудован и круглыми противотуманными фарами.

Интерьер Лады Х-Рей не менее интересный и оригинальный. Приборная панель незатейлива в целом по дизайну, однако по факту она достаточно информативна. Все приборы установлены в трех так называемых колодцах, а справа от водительского места вы можете увидеть экран бортового компьютера. Руль выполнен очень оригинально и современно, и имеет интересный четырехспицевый дизайн с ярко выраженным рельефом. В более «фаршированных» версиях Лада Х-Рей на руле также установлены кнопки для управления различными функциями.

Посредине торпеды разработчики установили семидюймовый ЖК-дисплей, вокруг которого расположены оригинальные с виду дефлекторы вентиляции. Чуть ниже установлен блок управления системой климат-контроля. Но это все характерно для автомобилей полной комплектации. Что касается более дешевых версий авто, то здесь все гораздо проще – вместо дисплея установлена обычная магнитола с простыми дефлекторами кондиционера или печки. В целом внутренняя отделка салона выполнена из жесткого текстурного пластика, а сами сиденья обтянуты приятной на ощупь тканью.
Передние кресла не только красивы с виду, но и очень удобны благодаря функции боковой поддержки и возможности регулировки. Так называемый высокий хэтчбек внутри оснащен множеством различных мини-отсеков для мелких вещей.

Основные из них расположены:

• в дверях, здесь находятся большие карманы с подстаканниками
• под передним пассажирским сидением есть выдвигающийся ящик
• под торпедой также расположены несколько отсеков и подстаканников

Заднее сиденье было правильно спроектировано, в результате чего пассажиры сзади никогда не будут себя чувствовать, «как шпроты в банке». Пассажирам предлагается довольно большой запас свободного пространства, но все без фанатизма.

Перейдем к объему багажника. В состоянии разложенных задних сидений объем багажника составляет 376 литров, в то время как при сложенных сидениях этот показатель увеличивается до 1382 л. Следует отметить, что при складывании сидений площадка получается идеально ровной. На дне багажника вы можете увидеть запасное колесо диаметром 15 дюймов, несмотря на то, что по факту авто оборудуется 16-дюймовыми колесами.

Потребителю предлагается на выбор одна из двух трансмиссий. Х-Рей оборудуется пятиступенчатой «механикой» и роботизированной КПП. Что касается механической коробки то, как заявили в свое время представители авто-концерна, АвтоВАЗ решил отказаться от собственных КПП. Теперь Лада Х-Рей будет комплектоваться «механикой» JR5 французского производства. Такое решение было принято в результате того, что инженеры АвтоВАЗа поняли, что трансмиссии французского производства работают гораздо тише отечественных.

Что касается «робота», то Х-Рей будет укомплектована той же коробкой передач, которая устанавливается на Ладу Весту. Эта роботизированная коробка была разработана на основе традиционной отечественной «механики», но в процессе создания агрегата участвовали специалисты из немецкой компании ZF. Зарубежные разработчики помогли российским специалистам модифицировать электронную часть. Система сцепления будет комплектоваться продукцией от всемирно известного разработчика Валео. Следует отметить, что установка роботизированной трансмиссии обусловлена не только невысокой ценой, но и экономией топлива. Кроме того, по утверждениям представителей концерна, теперь водитель получает возможность безболезненного старта движения на этой коробке в сильный мороз. В свою очередь, традиционные гидтротрансформаторные «автоматы» требуют немного времени, чтобы прогреться перед началом езды.

Лада Хрей оборудуется одним из трех четырехцилиндровых двигателей, которые полностью соответствуют требованиям экологического стандарт «Евро-5»:
Самый простой вариант – автомобиль оснащен 1. 6-литровым ДВС ВАЗ 21129 и 16-клапанным газораспределительным механизмом. Мощность автомобиля составляет 106 л.с. Коробка передач – механическая «пятиступка». Согласно заявленным характеристикам, до 100 км/ч Х-Рей может разогнаться за 11.9 сек, максимальная скорость в этом случае составляет 170 км/ч. Что касается расхода топлива, то по городу он составит около 7.5 л.

Средний вариант Лада Х-Рей будет оснащен 16-клапанным ДВС производства «Рено-Ниссан» объемом 1.6 л. ГРМ в этом двигателе будет цепным. Мощность авто, оснащенного механической КПП, составляет 114 «лошадок». Машина сможет разогнаться до 100 км/ч за 10.3 сек, а максимально возможная скорость разгона составляет 171 км/ч. Расход топлива в данном случае составит около 6.9 л в смешанном режиме езды.

Самая «совершенная» версия Лады Х-Рей оборудуется мотором ВАЗ 21176 объемом 1.8 л. Мощность двигателя составляет 122 л.с. В этом случае машинка оснащается 5-ступенчатой роботизированной коробкой передач. До «сотки» авто разгонится за 10. 9 сек, а максимально возможная скорость составит 183 км/ч. Что касается расхода топлива, то в режиме езды по городу он не должен превышать 7.1 л. Данные технические характеристики достаточно конкурентны в этом ценовом диапазоне.

Хэтчбек Лада Х-Рей представляет собой переднеприводное транспортное средство. Собственно, именно это стало причиной того, что Х-Рей не получил статус кроссовера. Однако на сегодняшний день множество других моделей так называемых городских внедорожников оборудуются только передним приводом.

По сообщению представителей АвтоВАЗа, Х-Рей оборудуются подвеской от Рено Сандеро и платформой шасси типа В0. По своей конструкции она представляет собой независимую схему со стойками МакФерсон. Задняя часть авто оснащена торсионной балкой, а конструкция в целом оборудована газовыми амортизаторами Tenecco и пружинами Mubea.

Полноприводная версия получит название Х-Рей Кросс, эта модификация в АвтоВАЗе считается уже кроссовером. Авто оборудуется платформой шасси от Renault Duster. Таким образом, Лада будет иметь независимую «ходовку». Спереди установлены стойки МакФерсон, а сзади многорычажная система. Также следует отметить, что полноприводные версии оснащаются электромагнитной муфтой Ниссан. Обе версии оборудованы дисковыми тормозами на передней оси, а также ГУРом.

Цена на Ладу Х-Рей, как и во всех других случаях, будет зависеть от комплектации. В продаже представлены несколько версий:

• Оптима.
• Комплектация Топ.
• Топ Престиж.

Даже в самой простой версии Lada X-Ray Оптима комплектация превзошла ожидания автоэкспертов. В частности, в ней уже имеются передние подушки безопасности, а также различные системы, такие как ABS, ASR, ESP, EBD и EBA. В целом комплектация Х-Рей выглядит достаточно солидно, поскольку она оснащена 16-дюймовыми «титанами», светодиодами в оптике, а также повторителями поворотов на зеркалах. Что касается интерьера, то здесь все тоже неплохо – передние стеклоподъемники, функция настройки руля по наклону, медиа-система с четырьмя динамиками, Блютуз, бортовой компьютер и мультируль. В автомобили с мощностью двигателя 110 «лошадок» добавляются кондиционер, а также система подогрева передних сидений.

В Топ версии ручки дверей будут выкрашенными, также добавятся «противотуманки» и даже система для правильной парковки — парктроник. Кроме того, комплектация дополняется электрическим приводом настройки зеркал, а также их обогревом, мультимедийной системой с GPS и семидюймовым экраном. Акустика авто модернизирована.

Лучшая комплектация Топ престиж имеет все функции, представленные выше. Помимо прочего, авто также оборудуется датчиками дождя, света, системой климат-контроля, обогревом ветрового стекла и даже камерой заднего вида! Кроме того, в версии Топ Престиж появится тонировка. Более полная информация, цена и комплектации представлены выше на картинках. Удачи в выборе характеристики и комплектации будущего автомобиля, если вам понравилась статья, то не забудьте поделиться ссылкой в социальных сетях.

В Ивановской области всмятку разбилась машина, в которой ехали трое детей (фото)

Для детей старше 16 лет. Газета рекламы, объявлений и новостей «Частник» — одна из самых популярных в Иваново и Ивановской области — представлена в Интернет-пространстве. Теперь с помощью Интернет-версии издания Вы можете разместить рекламу в газете, которую знает вся Ивановская область Подробнее

Сегодня «Частник» — это поставщик важнейшей бизнес-информации для деловых людей Ивановской области. Это рекламная газета с максимумом сведений, необходимых для потребителей и предпринимателей. Вот почему размещение рекламы в газете — это отличный способ найти своего клиента. Портал Частник.ru позволяет узнать самые последние новости политической, экономической, общественной и культурной сфер города Иваново и Ивановской области в режиме онлайн. Информацию, опубликованную в ленте новостей Частник.ru, активно используют федеральные информационные агентства и местные органы власти и СМИ. Портал предлагает своим посетителям сервис поиска по базе из около 70 тысяч актуальных строчных сообщений о купле-продаже всевозможной тематики: авто-мото, биржа труда, работа, вакансии, гаражи, для дома и быта, животные и растения, знакомства, жилая и коммерческая недвижимость, оборудование, стройматериалы, текстиль, потери и находки, бытовая техника, услуги и предложения, пассажирские и грузовые перевозки, а также многое другое. Каждый посетитель имеет возможность подать частные бесплатные и платные объявления с главной страницы сайта, разместить объявления в печатной версии газеты «Частник», ознакомиться с тарифами и дать рекламу в газету, осуществить оплату за размещение объявлений с помощью электронных платежных систем. На главной странице портала можно посмотреть электронную версию последних номеров газеты «Частник-Понедельник», «Частник-Среда», «Частник-Пятница», «Частник Шуя», специального выпуска Текстильного вестника «Ивановская Мануфактура» и ивановского журнала для молодоженов «Свадебное настроение». Узнавайте новости Ивановской области! Подавайте рекламу в газету и находите своих клиентов вместе с Частником Скрыть

Автоцентр АНТ — Главная

2020, U4G, 1.6 л, ( л/с), Бензиновый, Механическая, Передний

1 068 000 Р

1 168 000 Р

Забронировать

2020, PGU, 1.6 л, ( л/с), Бензиновый, Механическая, Передний

1 062 000 Р

1 162 000 Р

Забронировать

2021, Черный, 2 л, (144 л/с), Бензиновый, Вариатор, Передний

1 944 000 Р

1 864 000 Р

Забронировать

2020, Y2E, 2 л, ( л/с), Бензиновый, Автоматическая, Передний

1 864 000 Р

1 814 000 Р

Забронировать

2021, Белый, 2 л, (144 л/с), Бензиновый, Вариатор, Передний

3 400 000 Р

3 200 000 Р

Забронировать

2020, PGU, 1.6 л, ( л/с), Бензиновый, Механическая, Передний

881 000 Р

Забронировать

2020, RHM, 1. 6 л, ( л/с), Бензиновый, Автоматическая, Передний

1 037 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2015, Зеленый, 1700 л, (83 л/с), Бензин, Механическая, 4WD

444 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2018, Серый, 1600 л, (106 л/с), Бензин, Механическая, Передний

613 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2017, Белый, 2000 л, (144 л/с), Бензин, Вариатор, Передний

1 425 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

1998, Серебристый, 4500 л, (211 л/с), Бензин, Механическая, 4WD

785 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2018, Черный, 1600 л, (123 л/с), Бензин, Механическая, Передний

1 077 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2016, Белый, 2500 л, (181 л/с), Бензин, Автоматическая, Передний

1 787 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2013, Серый, 2400 л, (175 л/с), Бензин, Автоматическая, 4WD

1 427 000 Р

Забронировать

с пробегом одобрено ант

2007, Черный, 2700 л, (175 л/с), Бензин, Автоматическая, 4WD

675 000 Р

Забронировать

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart ⁴³ . кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены сайт-специфическим мутагенезом с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) ⁴³ и K206A (для Turquoise2-GL).Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно ¹⁹ . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Точно так же CFP в PicchuEV-x ^19,44,45 и RaichuEV-Ras ^19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для образования hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно. В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов. Варианты hyBRET-ERK NanoLuc также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее ²² . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS ⁴⁷ или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) ⁴⁸ .Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки компонентов, кодирующих кДНК hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP ⁴⁹ . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК. Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, и кДНК для голубого нано-фонаря и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее ⁵⁰ . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548-1020) или интер-Sh3-доменом p85 человека (aa 428-621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 ⁵¹ . Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Клеточная культура и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase ⁴⁸ , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T были котрансфицированы вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида № 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком от Dr. Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее ¹⁴ . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и фактор роста эпидермиса были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее ²⁰ . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε _c ( λ _из ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E _CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ _C — квантовая эффективность CFP, f _C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ _Y — квантовая эффективность YFP, f _Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε _Y ( λ _из ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. Модель ε _Y ( λ _из ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε _Y ( λ _из ) значение при 513 нм.

Если предположить, что слияние RLuc8 на С-конце в кадре не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _RC — это эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E _RY — это эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ _R — квантовая эффективность RLuc8, а f _R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E _CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E _{RC Предполагается, что} является постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E _RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ _CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E _RC было определено как 0,13. Наконец, E _RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.

Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _NC — это эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NY — это эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ _N — квантовая эффективность NanoLuc, а f _N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NC , был также оценен по формуле. 4, установка E _NY и E _CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. ⁵² .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом во время покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см ² в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для получения изображений BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума ⁵³ . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонаря и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать мембранную транслокацию слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом 490 нм (55 мкВт / см ² ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см ² ) или светом 490 нм (180 мкВт / см ² ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализы на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разбавленным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью считывающего устройства для микропланшетов GloMax Discover (Promega).Короткопроходной фильтр 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $$

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтой / голубой люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее ²⁶ . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантата и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 ⁶ клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена ⁵⁴ . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому вентилятору MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг / кг ^-1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Новый анализ пептида FRET выявляет эффективное ингибирование HtrA Helicobacter pylori посредством связывания цинка и меди

Новый анализ пептида FRET для определения активности

До сих пор активность H. pylori HtrA (HpHtrA) в основном исследовалась с помощью казеиновой зимографии или вестерн-блоттинга фрагментов субстрата, которые являются трудоемкими, медленными и низкопроизводительными методами ^28,34 . Технология FRET представляет собой новейшую методологию и позволяет проводить непрерывные анализы активности протеаз и высокопроизводительный скрининг ингибиторов протеаз. Для разработки анализа пептида FRET, содержащего оптимизированный сайт короткого расщепления для HtrA, мы выполнили глобальное профилирование специфичности для HtrA с использованием прямого анализа профилей протеазной специфичности в геле (DIPPS) ³⁵ .Анализируя HtrA-нацеленные протеомные пептиды, полученные из клеток MKN-28, мы обнаружили 2479 пептидов, которые были обработаны HtrA. Эти пептиды обычно расщеплялись после алифатических аминокислотных остатков V, I и A в положении P1, в то время как предпочтение отдается основным аминокислотным остаткам, таким как R и K, в положении P2. Специфичность других участков связывания, не являющихся первичными, была менее выраженной, при этом R показывает наибольшее обогащение в положении P3, а A — в положении P4. Было показано, что среди первичных сайтов аминокислоты A и K обогащены в положении P1 ‘и Y в положении P2’ (рис.1A, левая панель, фиг. S1). Обнаруженный характеристический профиль специфичности AR / QRV ↓ AY хорошо соответствует сигнатурному сайту [VITA] ↓ [VITA] -xxD- [DN], ранее идентифицированному в субстрате HtrA E-кадгерине, и подтверждает предпочтение HpHtrA расщеплять между гидрофобными аминокислотами. ¹¹ . Интересно, что последовательность AR / QRV ↓ AY напоминает линкерную область AQPVEA между EC5 и TMD E-кадгерина, которая уже была предложена в качестве предпочтительного сайта расщепления в E-кадгерине для HpHtrA во время процесса инфицирования ^11,12 , но еще не подтверждено экспериментально (рис.1А, правая панель). На основе этого уточненного паттерна сайта расщепления был получен пептид FRET, состоящий из оптимизированной последовательности AQRVAF, N-концевого флуорофора 2-аминобензоила (2-Abz) и C-концевого гасителя 3-нитротирозина Y (NO ₂ ). синтезированы (рис. S2). Он одинаково хорошо расщеплялся трипсином и HpHtrA с R и V, соответственно, в положении P1 (фиг. 1B и фиг. S3 и S4). Тушение внутримолекулярной флуоресценции пептида FRET было высокоэффективным (рис. S3), а расщепление с использованием трипсина и HtrA дикого типа (wt) выявило сильное усиление испускаемой флуоресценции, тогда как неактивный мутант HtrA (SA) не влиял на субстрат FRET ( Инжир.1С). Масс-спектрометрический анализ продемонстрировал HtrA-специфическое расщепление с V в положении P1 (рис. S4). Кинетика протеолитической активности увеличения концентраций HpHtrA wt продемонстрировала эффективное расщепление пептида FRET уже при низких концентрациях по сравнению с неактивным мутантом HtrA SA (фиг. 1D).

Новый анализ пептида FRET для обнаружения активности HtrA H. pylori . ( A ) Профиль специфичности расщепления HpHtrA, полученный при профилировании DIPPS, представлен как iceLogo со значительно обогащенными и недостаточно представленными аминокислотами выше и ниже оси x соответственно.Раздвижная пептидная связь между P1 и P1 ‘показана серой пунктирной линией на iceLogo. Модель справа представляет доменную структуру человеческого E-кадгерина (hCdh2), которая состоит из внеклеточного домена (EC1 – EC5), трансмембранного домена (TMD) и внутриклеточного домена (IC). Сайты расщепления HtrA были идентифицированы (красные стрелки) в сайтах связывания Ca ⁺⁺ , расположенных между отдельными областями EC. Согласно iceLogo, дополнительный сайт расщепления для HtrA присутствует в линкерной области между доменом EC5 и TMD.( B ) Последовательность AQRVAF, содержащая 2-аминобензоил (2-Abz) в качестве флуорофора и 3-нитротирозин Y (NO ₂ ) в качестве гасителя, гидролизуется трипсином с аргинином (R) в положении P1 и HpHtrA. с валином (V) в позиции P1. ( C ) 5 мкМ пептида FRET инкубировали с 250 нМ HpHtrA дикого типа (wt), его изогенно неактивным мутантом (SA) или 125 нМ трипсином в течение 180 мин в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4) при 37 ° C. ° C. Данные представляют собой относительные флуоресцентные единицы (RFU) ± S.D. с флуоресцентным сигналом, полученным от обработанного трипсином пептида FRET, установленного за 100%. Звездочки указывают на статистически значимые различия (**** p <0,0001). ( D ) 4 мкМ пептида FRET инкубировали с указанными концентрациями HpHtrA wt или SA в течение 180 мин при 37 ° C в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4). Данные представляют собой RFU ± S.D. с флуоресцентными сигналами, полученными от пептида FRET, обработанного 400 нМ HpHtrA wt в течение 180 мин, установленным как 100%.

Двухвалентные катионы Zn

Пептидный анализ FRET является подходящим подходом для скрининга лекарств для выявления и оптимизации ингибиторов HpHtrA.Zn ⁺⁺ может ингибировать широкий спектр неметаллопротеаз, включая трипсин, калликреин и тромбин ^33,36,37 . Следуя нашим наблюдениям, что ионы кальция эффективно предотвращают отшелушивание эктодомена E-кадгерина, покрывая HpHtrA-целевые сайты сигнатуры в субстрате ^11,12 , мы провели подробное исследование влияния двухвалентных ионов на активность HtrA H. pylori и расщепление субстрата. В первом подходе рекомбинантный HpHtrA инкубировали с казеином, состоящим из α _S1 -, α _S2 — и β-казеина в качестве субстрата, и анализировали расщепление в белковых гелях, окрашенных Кумасси (рис.2А). HpHtrA эффективно расщепляет β-, α _S1 — и, в меньшей степени, α _S2 -казеин (рис. 2A, дорожка 3). Среди протестированных ионов металлов Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ сильно ингибировали активность HtrA, что указывает на прямое влияние этих двухвалентных катионов на протеолитическую активность HpHtrA (фиг. 2A, дорожки 7 и 9). Хелатирующие агенты EDTA и EGTA добавляли в качестве контролей, и они не влияли на HtrA-опосредованную деградацию казеина (фиг. 2A, дорожки 12 и 13). Эти данные предполагают, что двухвалентные переходные металлы могут по-разному влиять на активность HpHtrA.Расщепление казеина под действием HtrA, экспрессируемого Borrelia burgdorferi (BbHtrA), аналогичным образом ингибируется Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ , а также наблюдали для DegP из E. coli и HtrA1 человека ³⁸ . Интересно, что кристаллическая структура гомолога HtrA A (HhoA) из фотосинтетической цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6,803 показал, что гексамерная структура содержит ион Zn ⁺⁺ в центральном канале, который инактивирует HhoA в анализе расщепления казеина ³⁹ .Эти данные подтверждают наши выводы о том, что HpHtrA можно ингибировать путем прямого связывания Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ .

Двухвалентные катионы модулируют активность HpHtrA. ( A ) 10 мкг казеина, состоящего из α _S1 -, α _S2 — и β-казеина, инкубировали с 250 нг HpHtrA в течение 16 ч при 37 ° C в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4). Где указано, добавляли 1 мМ различных двухвалентных ионов, EDTA или EGTA. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали кумасси бриллиантовым синим G250.( B ) 50 нг hCdh2 инкубировали с 250 нг HpHtrA в течение 16 ч при 37 ° C в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4). Где указано, добавляли 1 мМ различных двухвалентных ионов, EDTA или EGTA. Полноразмерный hCdh2 (Cdh2 ^FL , 125 кДа) и фрагменты расщепления hCdh2 детектировали вестерн-блоттингом с использованием антитела, распознающего домен EC5 hCdh2. HpHtrA и автоматически обработанный HpHtrA (HpHtrAs) детектировали с использованием поликлонального антитела к HpHtrA.

Чтобы определить, вызвано ли это ингибирование прямым воздействием на протеазу HtrA или вмешательством в субстрат казеина HtrA, мы дополнительно проанализировали влияние ионов металлов на HtrA-опосредованное расщепление E-кадгерина.Рекомбинантный человеческий E-кадгерин (hCdh2) инкубировали с рекомбинантным HpHtrA в течение 16 часов в присутствии различных двухвалентных катионов, как указано. Фрагменты hCdh2 были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела, распознающего домен EC5 E-кадгерина. На эффективное HpHtrA-опосредованное расщепление hCdh2 указывало наличие характерного HtrA-индуцированного паттерна фрагментации ¹¹ (фиг. 2B, дорожка 3). Добавление Ca ⁺⁺ значительно блокировало расщепление hCdh2, в то время как хелатирующие агенты EDTA и EGTA значительно усиливали фрагментацию hCdh2 по сравнению с одним только HpHtrA wt, как сообщалось ранее ¹² (рис.2B, дорожки 4, 12 и 13). Резкий ингибирующий эффект наблюдался после добавления Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ , поскольку HpHtrA-опосредованная фрагментация hCdh2 была сильно снижена (фиг. 2B, дорожки 7 и 9). Это согласуется с экспериментами по расщеплению in vitro с использованием казеина в качестве субстрата (рис. 2А). Эти данные предполагают, что Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ мешают активности HpHtrA, а не связываются с субстратом. Это явно контрастирует с Ca ⁺⁺ , который связывается с мотивами связывания Ca ⁺⁺ , расположенными между отдельными доменами EC.Связывание Ca ⁺⁺ необходимо для функциональных межмолекулярных взаимодействий в цис и транс между внеклеточными доменами E-кадгерина на соседних эпителиальных клетках. В частности, эти связывающие Ca ⁺⁺ мотивы были ранее идентифицированы как сайты расщепления для HtrA. Следовательно, связывание Ca ⁺⁺ маскирует мотивы и предотвращает дальнейшую фрагментацию растворимого внеклеточного домена 90 кДа E-кадгерина при инфицировании H. pylori ^11,12 .

Для дальнейшего уточнения ингибирующего действия Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ , мы провели эксперименты по титрованию, чтобы определить концентрации Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ , которые необходимы для ингибирования HtrA, используя анализ пептида FRET (фиг. 3A). Важно отметить, что добавление только Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ не гасило флуоресцентный сигнал (фиг. S5), подтверждая специфичность измерения и предполагаемое широкое применение пептида FRET для будущего скрининга лекарств.Относительная флуоресценция через 15 и 180 минут продемонстрировала, что возрастающие концентрации Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ значительно снижают активность HtrA (фиг. 3A). Значения половины максимальной ингибирующей концентрации (IC ₅₀ ), рассчитанные для Zn ⁺⁺ , составили 649,5 нМ (95% доверительный интервал 560–746,1 нМ) через 15 минут и 2,57 мкМ (95% доверительный интервал 2,382–2,774 мкМ) через 180 минут. мин. Cu ⁺⁺ показал IC ₅₀ 295,4 нМ (95% доверительный интервал 255.8–342,7 нМ) через 15 мин и 937,5 нМ (95% доверительный интервал 890,9–980,4 нМ) через 180 мин, что указывает на эффективную инактивацию HpHtrA. Ингибирование HpHtrA wt, обнаруженное в анализе пептида FRET, также сравнивали с экспериментами по расщеплению in vitro с использованием hCdh2 или казеина в качестве субстратов. В качестве контроля мы включили протеолитически неактивный мутант HpHtrA (SA) ^4,40 , который не обрабатывает hCdh2 или казеин. Zn ⁺⁺ явно ингибировал HpHtrA-опосредованную фрагментацию hCdh2 в концентрации 50 мкМ (рис.3B, дорожка 4) и более высокие концентрации Zn ⁺⁺ блокировали расщепление hCdh2 еще более эффективно (рис. 3B, дорожки 5-8). В отличие от расщепления hCdh2, на казеинолитическую активность HpHtrA не влияли низкие концентрации Zn ⁺⁺ или Cu ⁺⁺ (рис. 3C), что позволяет предположить, что казеин может поглощать Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ в виде ранее сообщалось ⁴¹ и, следовательно, мешает активности расщепления. Небольшой ингибирующий эффект можно было обнаружить при использовании 250 мкМ Zn ⁺⁺ или Cu ⁺⁺ , который усиливался при увеличении концентраций (рис.3С, дорожки 6–8). Для полного ингибирования расщепления казеина требовалось увеличение до 500–1000 мкМ (рис. 3C, дорожки 7–8). Различные концентрации, необходимые для эффективного ингибирования HpHtrA, обнаруженного в анализе пептида FRET и в эксперименте по расщеплению in vitro, могут быть связаны с повышенной доступностью пептида FRET, который содержит единственный консенсусный сайт расщепления, не зависящий от конформации, а не сложенные комплексные белки. Таким образом, мы пришли к выводу, что использование пептида FRET в качестве субстрата для HpHtrA является высокочувствительным и надежным подходом для количественной оценки активности HtrA.

ZnCl ₂ и CuCl ₂ ингибируют активность HpHtrA в зависимости от концентрации. ( A ) 5 мкМ пептида FRET инкубировали с 250 нМ HpHtrA и возрастающими концентрациями ZnCl ₂ (левая панель) или CuCl ₂ (правая панель) в течение 15 минут (черные столбцы) и 180 минут (серые столбцы). при 37 ° C в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4). Данные представляют собой относительные единицы флуоресценции (RFU) ± S.D. с флуоресцентными сигналами, полученными от пептида FRET, обработанного HpHtrA wt, установленным за 100%.Звездочки указывают на статистически значимые различия (**** p <0,0001; нс, недостоверно). ( B ) 50 нг hCdh2 инкубировали с 250 нг HpHtrA wt или неактивным мутантом (SA) и увеличивающимися концентрациями ZnCl ₂ (левая панель) или CuCl ₂ (правая панель) в течение 16 часов при 37 ° C в 50 мМ буфер HEPES (pH 7,4). Полноразмерный hCdh2 (Cdh2 ^FL ) и фрагменты расщепления были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела, распознающего домен EC5 hCdh2.HpHtrA и автоматически обработанный короткий HpHtrA (HpHtrAs) детектировали с использованием поликлональных антител. ( C ) 10 мкг казеина, состоящего из α _S1 -, α _S2 — и β-казеина, инкубировали с 250 нг HpHtrA wt или неактивным мутантом (SA) и с возрастающими концентрациями ZnCl ₂ (левая панель ) или CuCl ₂ (правая панель). После инкубации при 37 ° C в течение 16 ч белки были разделены с помощью SDS-PAGE и визуализированы путем окрашивания кумасси бриллиантовым синим G250.

Значения IC ₅₀ ингибирования Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ не находятся в пределах физиологических концентраций (концентрации в свободной плазме составляют ~ 10 ^-9 моль / л для Zn ⁺⁺ и ~ 1.6 × 10 ⁻¹¹ моль / л для Cu ⁺⁺ ) ⁴² . Однако в комбинации с ингибиторами сериновой протеазы цинк, как сообщается, является мощным усилителем умеренных низкомолекулярных ингибиторов ^33,37,43 . Несмотря на то, что не все сериновые протеазы содержат типичные сайты связывания Zn ⁺⁺ , которые характеризуются двумя остатками гистидина с их имидазольными боковыми цепями в качестве лигандов для Zn ⁺⁺ , было высказано предположение, что Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ связывается в активных карманах тромбина ³³ , трипсина ³³ и калликреина ³⁶ и связывает ингибитор с активным центром, что приводит к эффективному ингибированию.Эти исследования продемонстрировали, что более низкие концентрации как ингибитора, так и Zn ⁺⁺ были достаточны для сильного усиления ингибирующих эффектов. Поскольку мы обнаружили, что Zn ⁺⁺ блокирует активность HpHtrA, возникает соблазн предположить, что умеренные ингибиторы HtrA в сочетании с низкой концентрацией ионов Zn ⁺⁺ могут синергетически действовать как высокоэффективные цинк-опосредованные ингибиторы сериновой протеазы.

Zn

Для активации E.coli , гомолог HtrA DegP, который превращается в протеолитически активные олигомеры при связывании субстрата ⁴⁴ . Протеазы HtrA несут несколько доменов, которые критически важны для сборки и активности. Протеазы DegP / HtrA содержат сигнальный пептид (SP), расположенный на N-конце, за которым следует протеазный домен, который характеризуется каталитической триадой гистидина (H), аспарагиновой кислоты (D) и серина (S). Расположенные на С-конце домены PDZ1 и PDZ2 важны для распознавания субстрата и олигомеризации ⁴⁴ .Несколько регуляторных петель (например, LA, LD и петли L1 – L3) были исследованы для E. coli DegP, которые имеют сходство последовательностей с HpHtrA (рис. 4A, рис. S6A и рис. S6B). «Сиротский» аллостерический карман (I ₁₆₁ –S ₁₆₉ ), расположенный между доменом PDZ1 и доменом сериновой протеазы, был идентифицирован в рентгеновской структуре 2,6 Å HpHtrA, которая функционирует как важный межбелковый интерфейс ( Рис. 4B и Рис. S6B) ^45,46 . Этот аллостерический карман содержит аминокислотный мотив S ₁₆₄ , D ₁₆₅ , S ₁₆₆ и D ₁₆₈ , который необходим не только для стабильности и активности олигомеров HtrA ⁴⁵ , но и для связывания низкомолекулярные ингибиторы, которые блокируют активность HtrA ⁴⁶ .Хотя типичные связывающие Zn ⁺⁺ — или Cu ⁺⁺ мотивы, характеризующиеся богатыми гистидином участками, не присутствуют в этой области, HpHtrA и, в частности, аллостерическая петля могут содержать дополнительные Zn ⁺⁺ — и Cu ⁺⁺ -сайты связывания, состоящие из аспарагиновой кислоты (D), глутаминовой кислоты (E) или цистеина (C), которые могут одинаково хорошо связывать Zn ⁺⁺ или Cu ^{++ 47} . Поэтому мы хотели исследовать, могут ли Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ нацеливаться на аспарагиновые кислоты, экспонируемые в этой петле, которые ранее предполагались как лиганд-связывающие мотивы ^47,48 .Отдельные аминокислоты S ₁₆₄ , D ₁₆₅ , S ₁₆₆ и D ₁₆₈ были мутированы на аланин и проанализированы на стабильность олигомера (фиг. 4C). В то время как HpHtrA S ₁₆₄ A показал повышение стабильности олигомера при зимографии казеина и SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, олигомерные HpHtrA D ₁₆₅ A, HpHtrA S ₁₆₆ A и HpHtrA D ₁₆₈ A были полностью распались (Рис. 4C, левая и средняя панель), подтверждая, что эта петля играет важную роль в аллостерической регуляции HpHtrA.Протеолитически неактивный HpHtrA S ₂₂₁ A был включен в качестве отрицательного контроля, и чистота рекомбинантных белков HpHtrA была продемонстрирована в SDS-PAGE в денатурирующих условиях (фиг. 4C, правая панель). Основываясь на этих данных, мы предполагаем, что D ₁₆₅ , S ₁₆₆ и D ₁₆₈ в HpHtrA не требуются для протеолитической активности, а скорее для стабилизации активной конформации. Затем протеолитическую активность мутантов HpHtrA анализировали в экспериментах по расщеплению in vitro.Несмотря на то, что стабильность всех трех олигомеров HpHtrA была явно снижена, казеин (фиг. 5A) и гидролиз E-кадгерина (фиг. 5B) изменились лишь незначительно по сравнению с HpHtrA wt. Мы предполагаем, что ограниченная активность HtrA достаточна для расщепления субстратов в течение 16 часов инкубации. Кроме того, кинетику гидролиза субстрата мутантами HtrA исследовали с использованием пептидного анализа FRET. Количественная оценка показала, что мутация S ₁₆₄ или S ₁₆₆ привела к снижению протеолитической активности примерно на 30%.Мутация D ₁₆₅ или D ₁₆₈ вызывала еще большую потерю активности HpHtrA (фиг. 5C), предполагая, что мутации в петле серьезно влияют на стабильность, образование олигомеров и / или активность. Это наблюдение согласуется с нашими предыдущими данными, подчеркивая важность этой аллостерической области. Биоактивный лиганд, который был разработан для связывания с аллостерическим карманом, эффективно блокировал активность HtrA H. pylori и Campylobacter jejuni и, следовательно, трансмиграцию бактерий через эпителиальный барьер ⁴⁶ .

Петля, связывающая аллостерический лиганд, важна для стабилизации олигомера HtrA. ( A ) Модель HtrA, демонстрирующая структуру домена, показывающую сигнальный пептид (SP), расширенную линкерную область, содержащую петлю LA, домен протеазы с каталитической триадой гистидина (H), аспарагиновой кислоты (D) и серина ( S), а также домены PDZ1 и PDZ2. Домен протеазы также содержит регуляторные петли LD, L1, L2 и L3. Положение лиганд-связывающей петли выделено красным.( B ) Рентгеновская структура протеазного домена HpHtrA ⁴⁶ с S ₁₆₄ , D ₁₆₅ , S ₁₆₆ и D ₁₆₈ , указанными в лиганд-связывающей петле. S ₂₂₁ в активном центре выделен пурпурным цветом. ( C ) Олигомеризация и активность HpHtrA wt, HpHtrA S ₁₆₄ A, HpHtrA D ₁₆₅ A, HpHtrA S ₁₆₆ A, HpHtrA D ₁₆₈ A и HpHtrA S _{22, проанализированных на примере1 зимография (дорожки 1–6), невосстанавливающий SDS-PAGE (дорожки 7–12) и восстанавливающий SDS-PAGE (дорожки 13–18).}

Протеолитическая активность мутантов петли HpHtrA. Для анализа протеолитической активности HtrA wt и его изогенных мутантов HpHtrA S ₁₆₄ A, HpHtrA D ₁₆₅ A, HpHtrA S ₁₆₆ A, HpHtrA D ₁₆₈ A и неактивных HpHtrA S ₂₂₁ 10 мкг казеина ( A ) или 50 нг E-кадгерина (hCdh2) ( B ) инкубировали с 250 нг вариантов HtrA, как указано, в течение 16 ч при 37 ° C в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4). Расщепление казеина анализировали с помощью окрашенного кумасси SDS-PAGE, а расщепление hCdh2 определяли с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела, распознающего домен EC5 hCdh2.HpHtrA и автоматически обработанные HpHtrA были обнаружены, как указано. ( C ) Активность мутантов лиганд-связывающей петли анализировали с использованием пептида FRET в качестве субстрата. Пептид FRET 5 мкМ инкубировали с 250 нМ HpHtrA wt (черный кружок), HpHtrA S ₁₆₄ A (красный квадрат), HpHtrA D ₁₆₅ A (зеленый треугольник), HpHtrA S ₁₆₆ A (желтые перевернутые треугольники), и HpHtrA D ₁₆₈ A (синий ромб) в течение 180 мин при 37 ° C в 50 мМ буфере HEPES (pH 7,4). Данные представляют собой относительные флуоресцентные единицы (RFU) ± S.D. с флуоресцентными сигналами, полученными от пептида FRET, обработанного HpHtrA wt в течение 180 мин, установленного как 100%.

Поскольку аллостерическая петля важна для регуляции HpHtrA и связывания лиганда, мы дополнительно исследовали, влияют ли Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ на олигомеризацию HpHtrA через эту петлю. Белки HpHtrA обрабатывали Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ и олигомеризацию анализировали в белковых гелях, окрашенных Кумасси, в невосстанавливающих условиях. По сравнению с необработанным HpHtrA wt, мы наблюдали зависящий от концентрации эффект добавления Zn ⁺⁺ на олигомеризацию HpHtrA.Концентрация Zn ⁺⁺ , равная 50 мкМ, была достаточной для усиления олигомеризации или стабильности HpHtrA (фиг. 6A, левая панель, дорожка 2), что свидетельствует о прямом связывании Zn ⁺⁺ с HpHtrA. Используя анализ теплового сдвига, мы сначала определили температуру плавления около 75 ° C для HpHtrA wt, которая довольно высока и указывает на повышенную стабильность, которая позволяет выжить в стрессовых условиях. ^30,49 . Мутации D ₁₆₅ и S ₁₆₆ привели к увеличению термической денатурации HpHtrA, в то время как мутации S ₁₆₄ и D ₁₆₈ не повлияли на стабильность (рис.S7). Затем мутанты HpHtrA инкубировали с Zn ⁺⁺ . HpHtrA wt был стабилизирован при концентрации приблизительно 10 мкМ Zn ⁺⁺ . Аналогичный эффект был продемонстрирован для HpHtrA S ₁₆₄ A, что указывает на то, что Zn ⁺⁺ не мешает S ₁₆₄ . Однако Zn ⁺⁺ не стабилизировал HpHtrA, несущий мутации D ₁₆₅ , S ₁₆₆ или D ₁₆₈ (фиг. 6A, правая панель). Это можно объяснить либо наблюдением, что мутанты HpHtrA D ₁₆₅ A, HpHtrA S ₁₆₆ A и HpHtrA D ₁₆₈ A не могут образовывать стабильные олигомеры в целом, либо предположением, что Zn ⁺⁺ напрямую не образует связываются с аллостерической петлей, а скорее с активным карманом HpHtrA, как это было предложено для других сериновых протеаз ^33,36,37 .Чтобы ответить на этот вопрос, связывание Zn ⁺⁺ дополнительно анализировали с помощью термофореза на микромасштабах (MST) (таблица 1 и фиг. S8). Связывание Zn ⁺⁺ может быть обнаружено для HpHtrA wt ( K _d = 23 мкМ) и HpHtrA S ₁₆₄ A ( K _d = 55 мкМ) с сигналом до -шумность 6,3 и 6,0 соответственно. Хотя кривые связывания также были подогнаны для HpHtrA D ₁₆₅ A, S ₁₆₆ A и D ₁₆₈ A (рис.S8), отношения сигнал / шум были слишком низкими, чтобы доказать связывание Zn ⁺⁺ с белками (таблица 1). Cu ⁺⁺ также исследовали, но он сильно гасил флуоресцентный сигнал при высоких концентрациях, и поэтому анализ данных был невозможен (данные не показаны). Таким образом, наши результаты подтверждают гипотезу о том, что HpHtrA D ₁₆₅ и D ₁₆₈ участвуют во взаимодействии с Zn ⁺⁺ в качестве предполагаемого сайта связывания. Поскольку механизм активности HpHtrA еще не был интенсивно исследован, до сих пор неизвестно, требуется ли олигомеризация для протеолитической активности или HpHtrA образует активные олигомеры в зимограмме после ренатурации.Но на основании наших данных в этом отчете мы пришли к выводу, что аллостерическая петля важна для стабильности олигомерного HpHtrA. Взаимодействие с Zn ⁺⁺ может резко изменить конформацию HpHtrA, что приведет к увеличению стабильности олигомера, но также и к эффективному ингибированию протеолитической активности или распознавания субстрата. Подробный механизм олигомеризации и активности HpHtrA будет дополнительно исследован в будущем.

Ионы Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ мешают стабильности HpHtrA через аллостерическую петлю.Чтобы исследовать влияние ZnCl ₂ и CuCl ₂ на стабильность и активность олигомеров HpHtrA, HpHtrA wt инкубировали с возрастающими концентрациями ZnCl ₂ ( A ) и CuCl ₂ ( B ). и затем анализировали с помощью окрашенного кумасси SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях (левые панели). 4 мкМ рекомбинантного HpHtrA wt (черные кружки), HpHtrA S ₁₆₄ A (красные квадраты), HpHtrA D ₁₆₅ A (зеленые перевернутые треугольники), HpHtrA S ₁₆₆ A (желтые треугольники) и HpHtrA D ₁₆₈ A (синий ромб) инкубировали с SYPRO Orange и возрастающими концентрациями ZnCl ₂ и CuCl ₂ при изменении температуры от 25 до 95 ° C (увеличение на 0.5 ° C в минуту). Изменения температуры плавления ΔT _m представлены нормализованными к внутреннему T _m индивидуального мутанта HtrA (правые панели).

Данные, полученные в результате экспериментов с Cu ⁺⁺ , значительно отличаются от данных, полученных с Zn ⁺⁺ . HpHtrA wt был лишь слегка стабилизирован при низких концентрациях Cu ⁺⁺ , как было проанализировано с помощью окрашенного Кумасси SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях (рис.6Б, левая панель). Сравнивая мутанты HpHtrA в чувствительном анализе теплового сдвига, наблюдали два режима регуляции. При низких концентрациях Cu ⁺⁺ стабилизировал мутанты HpHtrA wt и HpHtrA S ₁₆₄ A, но не HpHtrA D ₁₆₅ A, HpHtrA S ₁₆₆ A и HpHtrA D ₁₆₈ A (рис. 6B, правая панель), напоминающие эффекты, обнаруженные в ответ на Zn ⁺⁺ (фиг. 6A, правая панель). Более высокие концентрации Cu ⁺⁺ окончательно дестабилизировали HpHtrA wt и HpHtrA S ₁₆₄ A.Интересно, что мутанты HpHtrA D ₁₆₅ A, HpHtrA S ₁₆₆ A и HpHtrA D ₁₆₈ A были более сильно дестабилизированы Cu ⁺⁺ (рис. 6B, правая панель), что указывает на то, что эти сайты в HpHtrA не только участвуют в стабильности олигомера, но также непосредственно нацелены на Cu ⁺⁺ . В заключение мы предполагаем, что Cu ⁺⁺ имеет два связывающих мотива в молекуле HpHtrA. Первый — это активный сайт, который представляет собой сайт связывания с высоким сродством для Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ и может связывать металлы уже в более низких концентрациях.Это было предложено для ряда сериновых протеаз, которые связывают Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ через гистидин в своих карманах ^33,36,37 . Второй мотив в молекуле HpHtrA представляет собой сайт связывания с низким сродством, образованный аллостерической петлей, связывание которой приводит к дестабилизации HpHtrA. Однако подробный механизм интерференции Zn ⁺⁺ и Cu ⁺⁺ с HpHtrA требует дальнейшего внимания и будет изучен в будущих исследованиях.

Структура раствора комплекса ESCRT-I по данным малоуглового рентгеновского рассеяния, ЭПР и FRET-спектроскопии

Реферат

ESCRT-I требуется для сортировки интегральных мембранных белков в лизосому или вакуоль в дрожжах, для цитокинеза в клетках животных и для отпочкования ВИЧ-1 из человеческих макрофагов и Т-лимфоцитов.ESCRT-I представляет собой гетеротетрамер Vps23, Vps28, Vps37 и Mvb12. Кристаллические структуры основного комплекса и варианта убиквитина E2 и С-концевых доменов Vps28 были определены, но внутренняя гибкость предотвратила кристаллизацию интактного ESCRT-I. Здесь мы охарактеризовали структуру ESCRT-I в растворе путем одновременного уточнения структуры по сравнению с малоугловым рентгеновским рассеянием и спектроскопией двойного электронно-электронного резонанса спин-меченых комплексов. Ансамбль, по крайней мере, из шести структур, включающий в себя одинаково населенную смесь закрытых и открытых конформаций, был необходим для соответствия всем данным.Этот структурный ансамбль был перекрестно подтвержден с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул, которая предположила наличие континуума открытых состояний. Таким образом, ESCRT-I в растворе, по-видимому, состоит приблизительно из 50% популяции одной или нескольких связанных закрытых конформаций, а остальные 50% составляют континуум открытых конформаций. Эти конформации обеспечивают ориентиры для структурного пути, с помощью которого ESCRT-I индуцирует мембранные зачатки.

Эндосомный сортировочный комплекс, необходимый для транспорта (ESCRT), комплексы необходимы для подавления убиквитин-зависимых рецепторов, биогенеза мультивезикулярных тел (MVB), почкования ВИЧ-1 и большинства других вирусов в оболочке, а также цитокинеза (1, 2) .От дрожжей до людей, ESCRT отрывают мембранные зачатки от цитозоля и отщепляют узкие шейки от их внутренней поверхности (3). ESCRT-I напрямую связывается с убиквитином через его домен варианта убиквитина E2 (UEV) (4) и функционирует вместе с ESCRT-II в зачатках мембран вдали от цитозоля (5) по неизвестному механизму. Основной путь выхода ВИЧ-1 из инфицированных клеток — через ESCRT-I (6–9). Цитокинез требует рекрутирования ESCRT-I в среднее тело (10, 11), которое является конечной связью между дочерними клетками.Эти роли сделали ESCRT-I мишенью для структурного анализа и разработки противовирусных препаратов (12, 13).

ESCRT-I состоит из одной копии каждого из Vps23, Vps28, Vps37 и Mvb12 в дрожжах (рис. 1 A ). Его структура характеризовалась по частям. Были определены структуры дрожжевых (рис. 1 B ) и человеческих доменов UEV, связанных с убиквитином (14, 15), и домена UEV человека, связанного с пептидами из ВИЧ-1 и ESCRT-0 (13, 16). ESCRT-I дрожжей связывается с ESCRT-II через C-концевой домен (CTD) Vps28 (17), структура которого была определена (18, 19) (рис.1 С ). Vps23, Vps28 и Vps37 собираются через тримерный субкомплекс, известный как «головной убор» (17, 20) (Fig. 1 D ). Vps23, Vps37 и Mvb12 образуют удлиненную ножку (21) (рис. 1 D ). Стебель и головной убор вместе составляют ядро. Четыре другие области отсутствуют в решенных структурах. Линкер, содержащий 60 остатков, соединяет UEV и стеблевую часть Vps23 и включает последовательность локализации в среднем теле (22). Гибкий линкер с 30 остатками соединяет головную часть и CTD Vps28.Предсказанная на N-конце спираль (NTH; Fig. 1 E ) Vps37 является основной, предполагается, что она в основном спиральная, и вносит вклад в связывание с мембраной (21). Гибкие гидрофобные остатки на С-конце Mvb12 могут быть убиквитин-связывающим доменом (23). Фундаментальным для понимания механизма ESCRT-I-обеспечиваемого зачатка мембран является лучшее понимание расположения функциональных доменов в трех измерениях.

Структурные домены и сайты маркировки. ( A ) Схема доменов четырех субъединиц ESCRT-I, окрашенных в синий (Vps23), красный (Vps28), серый (Vps37) и оранжевый (Mvb12), показывающий спекулятивную модель их ориентации относительно шейки мембранный бутон, адаптированный из исх.3. ( B ) UEV-домен Vps23. ( C ) CTD Vps28. ( D ) Сердечник в сборе. ( E ) NTH из Vps37. Сконструированные остатки Cys показаны в модели заполненных сфер.

ESCRT-I является представителем класса сигнальных, транспортных и регуляторных белков в этом диапазоне размеров, которые содержат внутренне неупорядоченные области. Этот класс представляет собой фундаментальную нерешенную проблему для структурных биологов. Наличие гибких областей препятствовало кристаллизации интактного ESCRT-I, тогда как низкая молекулярная масса комплекса (108 кДа) препятствовала ЭМ-анализу отдельных частиц.

Здесь мы сообщаем об усилиях по построению окончательной структуры раствора интактного ESCRT-I и разработке подхода к структурному анализу белковых комплексов среднего размера с областями внутреннего нарушения. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и ЯМР в растворе представляют собой мощную комбинацию (24), поскольку информация о глобальной форме из SAXS дополняет ограничения ЯМР на малых расстояниях. Естественным аналогом этого подхода для более крупных комплексов является комбинирование SAXS со спектроскопическими методами, которые дают ограничения более длинного диапазона за счет использования сайт-специфичного или селективного мечения.Эти методы включают двойной электронно-электронный резонанс (DEER) (25) и FRET-спектроскопию (26). Данные SAXS, DEER и FRET были собраны для ESCRT-I в растворе. Структура молекулярного моделирования была разработана для совместного уточнения структур белковых комплексов по сравнению с SAXS и спектроскопическими данными, что привело к улучшенной модели полной структуры ESCRT-I. Мы показываем, что ESCRT-I в растворе находится в равновесии между примерно равными популяциями открытых и закрытых конформаций. Мы описываем эти популяции в терминах набора из шести структур, которые служат снимками большего континуума состояний.

Результаты

SAXS ESCRT-I.

Структура раствора полноразмерного дрожжевого ESCRT-I, не содержащего Cys, была проанализирована методом SAXS. Кривая I ( q ) по сравнению с q показала особенности до q = 0,5 Å ^-1 (рис. 2 A ). Максимальный размер белка D _max был определен как 225 Å (фиг. 2 C ). Данные SAXS первоначально были проанализированы методом ab initio генерации огибающей (27). Полученный таким образом конверт (рис.2 D ) был удлиненным с большим лепестком на одном конце и меньшим на другом. Конверт позволил нам сделать визуально удовлетворительную посадку сердечника ESCRT-I, поместив стержень в удлиненный центр конверта, а головной убор — в одну долю (Рис. 2 E ). Однако в конверте не хватало деталей, чтобы расположить области UEV, CTD и NTH. Действительно, график Кратки (рис. 2 B ) характерен для частично развернутого или иным образом некомпактного белка (28).Принимая во внимание доказательства внутренней гибкости в соединяющих регионах ESCRT-I, целесообразность моделирования этих регионов в ab initio оболочке в уникальной конформации не ясна априори.

SAXS ESCRT-I. ( A ) Подгонка смоделированных кривых рассеяния [ I ( q )] к наблюдаемому рассеянию ESCRT-I. ( B ) График Кратки тех же экспериментальных данных и смоделированного рассеяния, показанных в A . Экспериментальные точки данных I ( q ) в A и B представляют собой среднее значение 10 последовательных измерений одного и того же образца, а полосы ошибок представляют стандартную ошибку среднего.( C ) Функция распределения пар [ P ( r )] для ESCRT-I. ( D ) Неэмпирическая молекулярная оболочка для ESCRT-I. ( E ) Суперпозиция двух уточненных EROS структур ESCRT-I. ( F ) Подгонка экспериментальных данных SAXS для A к значениям, вычисленным на основе структур, соответствующих как данным SAXS, так и DEER.

Уточнение ансамбля ESCRT-I SAXS.

Для выборки физических конфигураций ESCRT-I мы использовали крупнозернистую модель связывания с белками (29).Ядро, Vps23-UEV, Vps28-CTD и Vps37-NTH считались жесткими доменами. Взаимодействия между доменами обрабатывались на уровне остатков с помощью зависимых от аминокислот парных потенциалов и электростатических взаимодействий типа Дебая-Хюккеля. Гибкие линкерные пептиды, соединяющие четыре жестких домена, представлены в виде аминокислотных шариков на полимере с соответствующими потенциалами растяжения, изгиба и торсионного угла. Моделирование ESCRT-I методом Монте-Карло проводилось с использованием исходной модели, основанной на кристаллических структурах дрожжевого Vps23 UEV [Protein Data Bank (PDB) ID code 1UZX], дрожжевого Vps28 CTD (PDB ID code 2J9U), дрожжевого ESCRT-I core (код PDB ID 2P22), модель NTH в спиральной конформации и линкеры, созданные в стерически разрешенных, но в остальном произвольных конформациях.Полученные 10000 конформаций были сгруппированы и подогнаны под экспериментальную кривую I ( q ) с использованием ансамблевого уточнения программы SAXS (EROS) (30). Приемлемая подгонка может быть получена как минимум с двумя конформациями, имеющими одинаковый вес (рис. 2 A ). Однако ни одна единственная конформация не соответствовала данным I ( q ). Одна из двух конформаций более закрытая (черная, рис.2 E ), а другая более открытая (желтая, рис.2 E ). В более закрытой структуре оба домена UEV и CTD подходят близко к ножке в «цис», так что они оба находятся на одной стороне ножки. UEV и CTD не соприкасаются друг с другом даже в более закрытой конформации.

В более открытом строении CTD находится дальше от стебля, но все еще на грани cis , тогда как UEV отклонился от стебля, чтобы выступить за кончик стебля. В более открытой конформации нет прямых контактов между UEV или CTD и ядром.Без взаимодействий, позволяющих прочно удерживать эти домены на месте, открытая конформация, вероятно, представляет собой ансамбль структур, которые заполняют аналогичный объем рассеяния в растворе. Этот анализ привел нас к выводу, что по крайней мере половина популяции комплексов ESCRT-I в растворе принимает динамическую структуру, в которой UEV и CTD являются мобильными по отношению к ядру.

DEER EPR Анализ ESCRT-I.

Четыре набора уникальных пар Cys были сконструированы в конструкцию ESCRT-I дрожжей без Cys и помечены спиновым зондом (1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-∆3-пирролин-3-метил) метантиосульфонат (MTSL).Пары Cys были отобраны с использованием уточненных структур EROS, чтобы ограничить самые неоднозначные междоменные расстояния. Остатки, подверженные действию растворителя, в кристаллизованных областях были выбраны, чтобы не мешать сборке комплекса. Пара Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 была выбрана в кристаллизованной области головной части для использования в качестве контроля. Остальные три пары были разработаны для измерения положения одного из основных функциональных доменов относительно ядра. Vps23 Cys108 — Vps23 Cys256 позволил измерить разделение UEV-ядра.Vps28 Cys65 — Vps28 Cys 151 и Vps23 Cys223 – Vps37 Cys12 были использованы для измерения разделения CTD-ядра и NTH-ядра, соответственно.

Каждый меченый образец ESCRT-I давал интерпретируемые спектры DEER (рис. 3). При гауссовой аппроксимации контрольная пара Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 давала резко пиковое распределение P ( r ) с центром при 52 Å (таблица S1). Положения меток MTSL моделировались на структурах с использованием соответствующего распределения конформеров MTSL (31).Для контрольной пары распределение P ( r ), рассчитанное на основе смоделированных координат MTSL, отлично согласуется с экспериментом (рис. 3, , верхняя часть ). Таким образом, эта метка MTSL достоверно сообщает известное внутрикомплексное расстояние в ESCRT-I. Образцы Vps23 Cys108 — Vps23 Cys256 и Vps23 Cys223– Vps37 Cys12 дали распределения P ( r ) по гауссовскому подходу, которые были примерно в два раза шире, чем внутрикорпусный P ( r ), описанный выше (Таблица S1).Из широкого распределения P ( r ) для пар UEV-, CTD- и NTH-ядра мы делаем вывод, что все эти домены являются мобильными по отношению к ядру.

ОЛЕН ESCRT-I. ( Left ) Экспериментально наблюдаемая (сплошная) модуляция V ( t ) вместе с точками, рассчитанными из шести структурных кластеров. ( Right ) Гистограммы расстояний MTSL, вычисленных по моделям. Зеленые кривые на верхних панелях показывают результаты гауссовой регуляризации.

Комбинированная обработка SAXS и DEER.

Во избежание внесения зависящих от регуляризации артефактов в структурное уточнение, структуры были уточнены непосредственно по измеренным данным DEER V ( t ). Процедура EROS (30) была модифицирована, чтобы позволить одновременную подгонку данных SAXS и DEER с минимальным ансамблем структур. При уточнении ансамбля веса структуры w _k были изменены для улучшения согласования между вычисленными, усредненными по ансамблю величинами I ( q ), V _{( i , j )} ( t ) и измеренные I ^obs ( q ), сигналы.Чтобы найти минимальный набор структур, которые совместно учитывают данные SAXS и DEER, функция была минимизирована численно с использованием алгоритма поиска Монте-Карло, в котором веса структуры варьировались между w _k = 0 и w _k = 1 при ограничении. В приведенной выше формуле параметр μ контролирует количество n структур с ненулевым весом w _k > 0, что позволяет нам идентифицировать минимальный набор репрезентативных структур.При малых параметрах μ ≪ 1 мы получили очень хорошее совпадение с экспериментальными данными ( χ ² <1) со многими структурами в уточненном ансамбле ( n À1). При больших параметрах μ > 1 в ансамбле было очень мало структур с ненулевыми весами, но согласие с экспериментальными данными было неудовлетворительным ( × ² было значительно больше единицы). Баланс был достигнут при μ = 0,2, когда мы получили хорошее совпадение со всеми наборами экспериментальных данных ( χ ² ≈ 1) только с n = 6 структурами (рис.2 F и 3).

Качественно ансамбль из шести структур (рис. 4) напоминает открытые и закрытые конформации, используемые для соответствия данным SAXS, и заполняет одну и ту же общую область пространства. Самая закрытая из шести конформаций SAXS-EPR напоминает закрытую конформацию SAXS (Fig. 2 E ). В другой структуре UEV, CTD и NTH смещены из ядра в сильно растянутом состоянии. Остальные четыре имеют один или два домена в более закрытых состояниях. UEV сворачивается к цис-стороне стебля.В каждой из трех структур с закрытой конформацией UEV, UEV заполняет аналогичную область пространства, но разные поверхности UEV взаимодействуют с немного разными частями ядра. В одной из структур сайт связывания убиквитина (14) закрыт. NTH загибается вдоль стебля, так что аналогичные области пространства заполняются. Опять же, в каждом случае точный угол между NTH и ножкой меняется, как и детали молекулярных контактов. Два из трех закрытых состояний CTD включают уплотнение у дистального конца головки, которое образовано N-концевой половиной субъединицы Vps28.Эти закрытые конформеры заполняют одну и ту же область пространства и контактируют с одной и той же частью головного убора, но четырехспиральный пучок CTD повернут на 120 ° друг от друга в двух состояниях. В третьем состоянии CTD также контактирует с N-концевой половиной Vps28, но в этом случае заполняется немного другая область пространства, и CTD направлен обратно в сторону цис-стороны сердечника. Точные конформации закрытого состояния каждого из трех доменов достаточно различаются, поэтому нельзя сделать надежные выводы о детальной природе закрытого состояния или даже о том, существует ли единственная закрытая конформация.Примечательно, что даже в самых открытых конформациях избегается пространство на «транс» стороне стебля. Таким образом, даже в контексте очень гибкой и динамичной структуры существуют определенные предпочтения для доменов, занимающих одни области пространства над другими.

Структура решения ESCRT-I. Конструкции показаны с их относительными весами, полученными при подгонке, в процентах. Субъединицы окрашены, как на рис. 1.

Объемные измерения FRET.

Мы стремились проверить уточненную структуру ESCRT-I с независимыми данными, исключенными из уточнения.Массовые данные о времени жизни FRET были получены на образце, помеченном Atto488 и Atto594 на Cys137 и Cys223 Vps23, которые находятся в домене UEV и на ножке, соответственно. Эта пара обеспечивает независимую проверку разделения ядра UEV, в отличие от пары Cys108-Cys256, помеченной MTSL, используемой в уточнении. Время жизни донора оказалось равным τ _D = 3,7 нс, которое уменьшилось в присутствии акцептора до τ _DA = 3,4 нс (рис.S1). Эффективность FRET, рассчитанная на основе структур (см. SI Methods ), составила E = 0,11, что хорошо согласуется со средней эффективностью E = 0,09, измеренной в эксперименте с объемным FRET.

Одномолекулярный FRET.

Чтобы обеспечить независимую проверку пары Vps28 Cys65 – Cys151, пара была помечена как Alexa488 и Alexa594. Рис. 5 A и B сравнивает измеренные гистограммы эффективности FRET (светло-коричневые широкие полосы) с гистограммой, предсказанной на основе структур модели (черные узкие полосы).Чтобы проверить сборку ESCRT-I при концентрации 40 пМ, использованной для этих экспериментов, FRET также измеряли между парой межсубъединиц Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 (фиг. S2). Экспериментальные эффективности FRET, 〈 E _app 〉 = n _A / ( n _A + n _D ), рассчитанные из 2-мс бинов, содержащих более 50 фотонов (рис. 5 A ) или более 110 фотонов (рис.5 B ), были преобразованы в истинную эффективность FRET, 〈 E 〉, после корректировки фоновой и донорской утечки в акцепторный канал с использованием γ -фактора для корректировки различий в эффективности обнаружения донорные и акцепторные каналы и различия в квантовых выходах донорных и акцепторных красителей как 〈 E 〉 = n _A / ( n _A + γn _D ), с γ = 2, определенным из измерений времени жизни донора (32).

Одномолекулярный FRET. Сравнение экспериментальных (светло-коричневые широкие полосы) и расчетных (черные узкие полосы) гистограмм эффективности FRET с использованием расстояний между красителями для модельных структур для порогового числа фотонов ( n _T ) из ( A ) 50 и ( B ) 110 с интервалом времени ( T _bin ) 2 мс. На экспериментальной гистограмме эффективность FRET каждого бина составила γ , скорректированная после вычитания средних фоновых фотонов (донор: 0.6 мс ^-1 ; acceptor: 1,1 мс ^-1 ) и поправку на утечку флуоресценции донора в канал акцептора (6%). Всплески флуоресценции от меченных только донорами молекул ( E <0,18) были исключены, и данные были предварительно отфильтрованы для удаления всплесков фотонов, в которых происходило либо мигание, либо обесцвечивание. ( C ) Предполагаемая модель для открытого состояния ESCRT-I ( Верх ), состоящего из континуума конформаций, в равновесии с закрытым состоянием ( Низ ), состоящим из одной или нескольких связанных конформаций.

Проверка модели по результатам измерений FRET.

FRET была рассчитана для двойного мутанта Vps28 Cys65 / Cys151 и в целом хорошо согласуется с экспериментом (фиг. 5 A и B ). Низкая эффективность хвоста измеренного распределения не наблюдается на предсказанной гистограмме. Что еще более важно, предсказанная гистограмма содержит два различных пика на E ∼ 0,60 и E ∼ 0,85, которые окружены одним широким пиком экспериментальной гистограммы.Эта разница более выражена в распределении, полученном из бинов с более высоким порогом фотонов ( n _T ) из 110 фотонов, где ширина дробового шума уже (рис. 5 B ). Возможными источниками этой разницы в измеренных и предсказанных гистограммах являются ( и ) взаимное преобразование между кластерами конформаций в течение 2-миллисекундного интервала времени, которое приводит к интервалам с эффективностью FRET, промежуточной между закрытой и открытой конформациями, Ориентационное движение красителей сравнимо или медленнее, чем время бина, из-за прилипания красителей к белку для получения диапазона значений фактора ориентации κ ² , и ( iii ) предсказанные структуры не включают конформации с промежуточной эффективностью FRET.

Первая возможность была оценена с использованием простой кинетической модели обратимых конформационных изменений между двумя состояниями, при этом каждый из трех кластеров в пределах открытого или закрытого набора конформаций рассматривается как одно состояние. Эта модель сравнивалась с гистограммами эффективности FRET, построенными с различными временными интервалами, как описано в SI Analysis , из чего мы пришли к выводу, что динамика, скорее всего, не отвечает за расширение экспериментальной гистограммы. Вторая возможность была рассмотрена путем измерения значений поляризационной анизотропии для донорных и акцепторных красителей.Значение анизотропии донора ( r _a ) выше, чем ожидалось, исходя из срока службы донора ( τ _D ) и времени реориентационной корреляции ( τ _c ) приблизительно 0,74 нс для свободно переориентирующихся красителей, определенных на основе измерений анизотропии с временным разрешением (33) (см. Таблицу S2). Время переориентационной корреляции красителей ( τ _c ), рассчитанное из и θ = 0 (угол между диполями поглощения и излучения), составляет 1-2 нс, что указывает на то, что динамика красителя не увеличивает ширину на гистограмму эффективности FRET сверх вклада дробового шума ( SI Анализ ), но может, поскольку κ ² ≠ 2/3, вызвать небольшой сдвиг пиков эффективности FRET по сравнению с пиками, соответствующими свободному переориентации красители.Вывод из приведенного выше анализа состоит в том, что единственный широкий пик измеренной гистограммы, вероятно, отражает присутствие дополнительных конформаций, еще не учтенных при моделировании.

Обсуждение

Здесь мы применили комбинацию методов — SAXS, DEER и FRET — которые проверяют общую форму вместе с расстояниями между конкретными парами остатков в ESCRT-I.

Наблюдения здесь подтверждают ожидание того, что каждый дополнительный метод добавляет к общему информационному содержанию и более четко определяет структуру решения.Набор из трех значений R _H для конструкций ESCRT-I ранее можно было интерпретировать в терминах единой открытой структуры (21). Данные SAXS могут соответствовать как минимум двум структурам, одной открытой и одной закрытой. Данные SAXS и DEER вместе могут соответствовать минимум шести, охватывая спектр более открытых и закрытых конформаций UEV, CTD и NTH относительно ядра. В более ранней гидродинамической модели ESCRT-I находился полностью в открытом состоянии. Действительно, информационного содержания предыдущего гидродинамического исследования, содержащего только три точки данных, было недостаточно для определения более чем одного состояния для трех областей.Главный вывод, который следует из настоящего анализа, — это неожиданное существование примерно 50% популяции закрытых конформаций.

Одним из самых неожиданных аспектов анализа было ограничение, накладываемое информацией о распределении в спектрах DEER. Для трех пар домен-ядро каждый из этих спектров привел к широкому распределению P ( r ) в гауссовой аппроксимации. Хотя эти распределения не использовались при уточнении, широкий набор из шести структур, возникающих в результате уточнения, отражает ту же основную конформационную гетерогенность.Гистограммы FRET одиночных молекул обеспечивают прямое измерение отобранного конформационного пространства. Пара меток ядро-CTD показала один очень широкий пик на гистограмме, который отлично перекрывался с рассчитанной гистограммой, что дает нам уверенность в модели, полученной из SAXS и DEER. Широкий и относительно безликий характер эффективности FRET подчеркивает вероятное присутствие промежуточных конформаций между шестью структурами, используемыми для соответствия данным SAXS и DEER. Важно отметить, что нет никаких доказательств того, что существует ровно шесть (или какое-то другое конкретное число) дискретных конформаций.Мы рассматриваем эти шесть структур как моментальные снимки, которые охватывают и представляют большее конформационное пространство, отобранное ESCRT-I (рис. 5 C ), концепция, поддерживаемая гистограммами FRET и широкими распределениями P ( r ) из ОЛЕНЬ.

В текущей модели ESCRT-управляемого зачатка мембраны множественные копии ESCRT-I и -II собираются, чтобы сформировать кольцо на шейке зачатка (3). Локализация ESCRT-I в шейках почек in vitro наблюдалась непосредственно (5), но природа и структура предполагаемой мембраносвязанной сборки ESCRT-I-II неизвестны.У дрожжей внутрипросветные пузырьки (ILV) в MVBs имеют диаметр 22-26 нм (34). Если предположить, что шейка бутона имеет аналогичные размеры с самим бутоном, подразумевается, что окружность шейки почки составляет приблизительно 75 нм. С максимальным размером 22 нм, видимым здесь, по крайней мере четыре комплекса ESCRT-I, выровненных от конца до конца, будут необходимы, чтобы охватить шейку почки. Внутренняя гибкость, наблюдаемая для приблизительно 50% комплексов ESCRT-I в растворе (Fig. 5 C , Top ), позволила бы комплексу регулировать свою структуру на пути биогенеза почек.После включения с ESCRT-II в мембраносвязанную сборку предсказывается единственная конформация, возможно, соответствующая закрытому состоянию, наблюдаемому в другом приблизительно 50% популяции раствора (фиг. 5 C , Bottom ). Структура раствора будет полезна в качестве ориентира для структурного пути сборки ESCRT-I-II, ответственной за индукцию шейки почки. Хотя SAXS неосуществим в настройке мембраны из-за рассеяния от липосом, методы DEER и FRET могут быть перенесены.Таким образом, сравнение спектров в растворе и в мембраносвязанных условиях может предоставить первый шаг к пониманию конформационных изменений, участвующих в формировании сборки шейки почки. Роль конформационных изменений в ESCRT-I-обеспечиваемом почковании ВИЧ-1 является еще более актуальным вопросом. Эти спектроскопические методы также должны быть переносимы в настройку ВИЧ-1, как только реакция почкования ВИЧ может быть восстановлена ​​in vitro.

Успехи и ограничения этого анализа предлагают уроки для интеграции глобальных и конкретных структурных данных на частично гибких комплексах.EROS-анализ данных SAXS выявил ансамбль структур, способных согласовать данные, но не имел информации о различном поведении отдельных доменов. Маркировка, привязанная к конкретному участку, дает важную дополнительную информацию. Сайт-специфичное спин-мечение и DEER-спектроскопия предоставили прямые доказательства того, что каждый отдельный домен был конформационно гетерогенным по отношению к ядру, вывод, который мы не могли сделать только на основе анализа SAXS. Мы использовали другой сайт-специфический структурный зонд, FRET-спектроскопию, чтобы подтвердить выводы, сделанные из двух других методов, и выявить присутствие конформационных промежуточных продуктов, которые не были обнаружены другими методами.Мультисубъединичные комплексы представляют собой серьезную проблему в структурной биологии, и интеграция ограничений от множества методов, вероятно, будет иметь решающее значение для развития молекулярного понимания функции.

Материалы и методы

При уточнении ансамбля номер N и вес w _k структур k в ансамбле были получены путем одновременной подгонки к данным SAXS и DEER. Интенсивность рассеяния I _k ( q ) структуры k рассчитывалась, как в работе.30 и усреднены по ансамблю. Отклонения от измеренной интенсивности МУРР I ^obs ( q ) были определены количественно путем суммирования по N _q q точкам на кривой интенсивности, с c константа, определяемая условием. Чтобы уточнить данные DEER, возможные конформации шести меток MTSL на доменах ESCRT-I были созданы с помощью многомасштабного моделирования модуля Matlab макромолекулярной системы (31). Путем соответствующего переноса и поворота координат MTSL ротамеры были размещены на жестких доменах всех структур ESCRT-I в ансамбле.Для каждой пары меток MTSL ( i , j ) и конфигурации k комплекса ESCRT-I в ансамбле функция диполярной эволюции была рассчитана с D _{провалом} = 52,04 МГц нм ³ . Среднее значение для всех конформаций метки MTSL, с r _αβ расстояние между спиновыми метками α и β, прикрепленными к остаткам i и j , соответственно. Для проверки модели DEER метки MTSL были прикреплены к остаткам 27 и 173 в одном и том же жестком домене.Вычисленная функция диполярной эволюции V _(27,173) ( t ), таким образом, одинакова для каждой структуры k и, как было обнаружено, хорошо согласуется с измеренным сигналом DEER (см. Рис. 3, Top ). Для остальных трех пар меток ( i , j ) = (108,256), (12, 223) и (65, 151) функция дипольной эволюции была усреднена по ансамблю, Отклонения от измеренных сигналов DEER были определены количественно, с помощью которых суммируется N _t точек на кривой, с глубиной модуляции λ , полученной из.Статистическая ошибка оценивалась по уровню шума экспериментальных данных.

Благодарности

Мы благодарим B. Beach и M. Kostelansky за подготовку конструкции ESCRT-I без Cys, а также A. Bax за обсуждения. Данные SAXS были собраны в Стэнфордской лаборатории синхротронного излучения (SSRL), национальном пользовательском объекте, управляемом Стэнфордским университетом от имени Управления фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США. Программа SSRL по структурной молекулярной биологии поддерживается Министерством энергетики, Управлением биологических и экологических исследований, а также Национальными институтами здравоохранения, Национальным центром исследовательских ресурсов, Программой биомедицинских технологий.Б. была поддержана Международной исходящей стипендией Марии Кюри в рамках 7-й Рамочной программы Европейского сообщества. Эта работа была поддержана Внутренней программой Национальных институтов здравоохранения (NIH), Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (WAE, GH и JHH), Целевой антивирусной программой по борьбе со СПИДом в больнице. Директор NIH (JHH), NIH Grant GM072694 (DSC) и грант Министерства образования, молодежи и спорта Чешской Республики MSM0021620835 (J.В.).

Сноски

• Авторы: E.B., W.A.E., D.S.C., G.H., and J.H.H. спланированное исследование; E.B., B.R., D.Z.H., H.S.C., J.V. и G.H. проведенное исследование; Э. Б., Б. Р., Г. Х. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; E.B., B.R., D.Z.H., H.S.C., J.V., W.A.E., D.S.C., G.H. и J.H.H. проанализированные данные; и W.A.E., G.H. и J.H.H. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1101763108/-/DCSupplemental.

Наноскопические оптические линейки за пределами расстояния FRET: основы и приложения

Наноскопические оптические линейки за пределами расстояния FRET: основы и приложения

В последние несколько десятилетий линейки спектроскопии на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) служили ключевым инструментом для понимания химических и биохимических процессов, даже на уровне отдельных молекул.Поскольку процесс FRET происходит из диполь-дипольных взаимодействий, масштаб длины линейки FRET ограничен максимумом 10 нм. Недавно ученые сообщили об оптической линейке дальнего действия на основе наноматериалов, в которой можно преодолеть предел зависимости оптической линейки FRET от расстояния, и которая может быть очень полезна для мониторинга биологических процессов, происходящих на большем расстоянии, чем в масштабе 10 нм. Развитие наноскопических оптических линейок большого радиуса действия за последние десять лет показывает, что, помимо их способности работать на больших расстояниях, их яркость, длительный срок службы, отсутствие мерцания и химическая стабильность делают линейки на основе наночастиц хорошим выбором для оптических зондов большого радиуса действия.В текущем обзоре обсуждаются основные концепции и уникальные светофокусирующие свойства плазмонных наночастиц, которые полезны при разработке дальнодействующих одномерных и трехмерных оптических линеек. Кроме того, чтобы предоставить читателям обзор захватывающих возможностей в этой области, в этом обзоре обсуждаются применения линейок дальнего действия для мониторинга биологических и химических процессов. В заключение мы рассуждаем о роли оптических линейок дальнего действия в будущих научных исследованиях и обсуждаем возможные проблемы, перспективы и будущие потребности в использовании оптических линейок в технологических приложениях.

У вас есть доступ к этой статье

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает донор флуорофора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцептору хромофору без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансной передаче энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем эффекты растворителя на коротких расстояниях, а диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая в первую очередь зависит от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано излучением фотонов и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В экспериментах этого типа степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто используется для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках является отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в широком спектре типов клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс приводит к отсутствию флуоресцентного излучения акцептора (GFP).

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белков-партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может происходить, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансный перенос энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается усиленное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, должны быть выполнены несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор, составляющим приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) может быть вычислено из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [