Цены снижены! Бесплатная доставка контурной маркировки по всей России

Дорожный знак звездочка красная: Дорожный знак снежинка красная

Содержание

Что означают молоточки под знаком?

Что означает дорожный знак два скрещенных молотка?

Между знаком «кирпич» и стрелкой, указывающей на выделенную полосу, дорожные рабочие монтируют третий. Два скрещенных молотка означают, что запрет действует только по рабочим дням. Всего по городу повесят 2,5 тысячи таких табличек.

Что означает дорожный знак молотки?

Знак «Рабочее время» (молоточки)

Какой знак запрещает стоянку в рабочие дни?

Какая из комбинаций знаков запрещает только стоянку в рабочие дни? Дорожный знак 3.35 запрещает стоянку всех транспортных средств.

Что означает Снежинка под знаком?

Она называется «Субботние, воскресные и праздничные дни» (8.5.1). Табличка «Красная снежинка», установленная с каким-либо знаком, означает, что данный знак будет «работать» только в выходные (субботние, воскресные) и праздничные дни.9 мая 2013 г.

Какие дни считаются выходными в пдд?

Действительно, табличка «Рабочие дни» устанавливается с каким-либо знаком и указывает на то, что данный знак «работает» только в те дни, которые считаются рабочими.

Это — период с понедельника по пятницу (кроме праздничных дней).25 мая 2015 г.

Что означает красная звездочка на дорожном знаке?

Красная звёздочка – часть знака. Знак обозначает место, с которого начинается территория (участок дороги), на которой разрешено движение только пешеходов. Никакой дополнительной информации о праздничных и выходных этот знак по правилам ПДД не несёт.29 мая 2018 г.

Что означает знак кирпич со временем?

Что означает дорожный знак «кирпич»

3.1 «Въезд запрещен». Запрещается въезд всех транспортных средств в данном направлении.

Что означает знак движение запрещено?

Знак 3.2 запрещает дальнейшее движение транспортных средств. За исключением: Транспортные средства лиц перевозящих инвалидов, а так же детей-инвалидов. …

Что запрещает знак стоянка запрещена?

Знак 3.28 запрещает стоянку всех транспортных средств, но не запрещает остановку, даже если она займет более 5 минут (для посадки или высадки пассажиров, погрузки или разгрузки ТС). Распространяет свое действие только на ту сторону проезжей части, на которой установлен знак.

Что означает знак снежинка в треугольнике?

Таким образом, если увидите на дороге знак снежинка в треугольнике, следует проявлять осторожность, дальше может наблюдаться скользкий участок дороги, либо знак предупреждает об обилии снега. Также и другие знаки со снежинками в треугольнике указывают на то, что дорога является снежной или, так сказать, зимней.

Что означает знак точка в треугольнике?

На дорогах Запорожья появился новый предупреждающий дорожный знак – красный треугольник с черной точки внутри. … Этим знаком обозначается участок дороги с большой концентрацией ДТП – место, где по статистике произошло большое количество аварий с пострадавшими.

Круглый дорожный знак белый с красным


Запрещающий дорожный знак 3.2 Движение запрещено в Правилах дорожного движения

 
 
 
ПДД: Запрещающий дорожный знак 3.4 Движение грузовых автомобилей запрещено в Правилах дорожного движения
Суть: Дорожный знак 3.4 Движение грузовых автомобилей запрещено запрещает движение грузовиков, тракторов, самоходных машин и составов транспортных средств с массой более 3,5 т или иной. Есть исключения.
Текст ПДД 2015:  Запрещающий дорожный знак 3.4 Движение грузовых автомобилей запрещено без указания конкретной максимальной разрешённой массы автомобиля означает запрет проезда грузовых автомобилей с разрешенной максимальной массой боле 3,5 тоннЗапрещающий дорожный знак 3.4
Движение грузовых автомобилей с разрешенной максимальной массы более 8 тонн запрещено
с указания массы автомобиля означает запрет проезда грузовых автомобилей, превышающих указанную на знаке разрешенную максимальную массу
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ПДД: Запрещающий дорожный знак 3.20 Обгон запрещен в Правилах дорожного движения
Суть: Знак 3.20 Обгон запрещен запрещает обгон всех транспортных средств, кроме тихоходных средств, гужевых повозок, велосипедов, мопедов и двухколесных мотоциклов без коляски до ближайшего перекрёстка.
Текст ПДД 2015:  Запрещающий дорожный знак 3.20 Обгон запрещен в Приложении 1 к ПДДЗапрещающий дорожный знак 3.21 Конец зоны запрещения обгона
в Приложении 1 к ПДД
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Предупреждающие знаки ПДД 2019 с пояснениями

1.1 Железнодорожный переезд со шлагбаумом Подробнее
Описание знака

Черный забор в треугольнике с красной рамкой или окантовкой.

Предупреждает о приближении к железнодорожному переезду. Вне населённого пункта (н.п.) устанавливается на расстоянии 150-300 м, в населённом пункте — на расстоянии 50-100 м. Знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Запрещается: а) обгон на ж/д переездах и ближе, чем за 100 м перед ними; б) остановка и стоянка на ж/д переездах; в) стоянка ближе 50 м от ж/д переездов; г) разворот; д) движение задним ходом; е) провозить через переезд в нетранспортном положении сельскохозяйственные, дорожные, строительные и другие машины; ж) движение тихоходных машин, скорость которых менее 8 км/ч, а также тракторных саней-волокуш без разрешения начальника дистанции пути; з) объезжать с выездом на полосу встречного движения стоящие перед закрытым шлагбаумом ТС; и) самовольно открывать шлагбаум.

1.2 Железнодорожный переезд без шлагбаума Подробнее
Описание знака

Черный паровоз в треугольнике с красной рамкой или окантовкой.

Предупреждает о приближении к ж/д переезду без шлагбаума. Вне населённого пункта (н.п.) устанавливается на расстоянии 150-300 м, в населённом пункте — на расстоянии 50-100 м. Знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Запрещается: а) обгон на ж/д переездах и ближе, чем за 100 м перед ними; б) остановка и стоянка на ж/д переездах; в) стоянка ближе 50 м от ж/д переездов; г) разворот; д) движение задним ходом; е) провозить через переезд в нетранспортном положении сельскохозяйственные, дорожные, строительные и другие машины; ж) движение тихоходных машин, скорость которых менее 8 км/ч, а также тракторных саней-волокуш без разрешения начальника дистанции пути; з) объезжать с выездом на полосу встречного движения стоящие перед красным светофором;

1.3.1 Однопутная железная дорога Подробнее
Описание знака

Белый крест с красной окантовкой

Устанавливается непосредственно перед ж/д переездом.

Устанавливается только при наличии одного пути.

1.3.2 Многопутная железная дорога Подробнее
Описание знака

Белый крест с красной окантовкой

Устанавливается непосредственно перед ж/д переездом.

Устанавливается при наличии двух и более путей (3, 4, 5 и т. д.). При отсутствии шлагбаумов на железнодорожном переезде знаки 1.3.1 и 1.3.2 определяют размер переезда.

1.4 Приближение к железнодорожному переезду Подробнее
Описание знака

Красные полоски на белом фоне

Дополнительное предупреждение о приближении к железнодорожному переезду вне населенных пунктов. Устанавливаются вне н. п. на расстоянии 150-300 метров, при этом расстояние между знаками пропорциональное.

Знаки 1.4.1-1.4.3 устанавливаются с правой стороны дороги. а знаки 1.4.4-1.4.6 — с левой.

1.5 Пересечение с трамвайной линией Подробнее
Описание знака

Трамвай в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м. до пересечения с трамвайной линией, вне н. п. — за 150-300 м, может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

1.При одновременном праве на движение (когда транспортные средства находятся в равнозначных условиях) водители трамваев имеют преимущество. 2. Вне перекрестков, где трамвайные пути пересекают путь движения безрельсовых транспортных средств, трамвай имеет преимущество, кроме случаев выезда из депо. 3. При «разводке» транспортных средств на пересечениях отсутствует понятие «под прикрытием трамваев».

1.6 Пересечение равнозначных дорог Подробнее
Описание знака

Черный крест в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

На таких перекрестках равнозначных дорог обгон запрещен всех видов транспорта всеми транспортными средствами.

1.7 Пересечение с круговым движением Подробнее
Описание знака

Черные стрелки по кругу в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

При подъезде к такому пересечению рекомендуется снизить скорость до безопасных пределов и руководствоваться правилами проезда перекрестков.

1.8 Светофорное регулирование Подробнее
Описание знака

Светофор белом треугольнике с красной окантовкой

Перекресток, пешеходный переход или участок дороги, движение на котором регулируется светофором. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак предупреждает о приближении к перекрестку, пешеходному переходу или участку дороги, движение на котором регулируется светофором. Желтый фон на знаке 1.8, установленных в местах производства дорожных работ, означает, что эти знаки являются временными. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.9 Разводной мост Подробнее
Описание знака

Открытый мост белом треугольнике с красной окантовкой

Разводной мост или паромная переправа. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1«Расстояние до объекта».

Знак обязательно повторяется вне населенного пункта, при этом повторный знак устанавливается на расстоянии не менее 50 м.

1.10 Выезд на набережную Подробнее
Описание знака

Машина падает в воду в белом треугольнике с красной окантовкой

Выезд на набережную или берег. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак обязательно повторяется вне населенного пункта, при этом повторный знак устанавливается на расстоянии не менее 50 м.

1.11.1 Опасный поворот (правый) Подробнее
Описание знака

Кривая черная линия направо в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Разница в направлении поворота (направо, налево). Знак информирует только о направлении первого поворота за знаком.

1.11.2 Опасный поворот (левый) Подробнее
Описание знака

Кривая черная линия налево в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Разница в направлении поворота (направо, налево). Знак информирует только о направлении первого поворота за знаком.

1.12.1 Опасные повороты (с первым поворотом направо) Подробнее
Описание знака

Изогнутая черная линия в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги с опасными поворотами. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак информирует, что впереди ряд (или несколько) поворотов, при этом знак 1.12.1 указывает, что первый поворот после знака направо.

1.12.2 Опасные повороты (с первым поворотом налево) Подробнее
Описание знака

Изогнутая черная линия в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги с опасными поворотами. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак информирует, что впереди ряд (или несколько) поворотов, при этом знак 1.12.1 указывает, что первый поворот после знака налево.

1.13 Крутой спуск Подробнее
Описание знака

Проценты под наклоном в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак 1.13 может устанавливаться без таб.8.1.1 непосредственно перед крутым спуском или подъемом. Уступить дорогу, при наличии препятствия на уклонах, обозначенных знаками 1.13 и 1.14, должен водитель ТС, движущегося на спуск.

1.14 Крутой подъем Подробнее
Описание знака

Проценты под наклоном в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак 1.14 может устанавливаться без таб.8.1.1 непосредственно перед крутым спуском или подъемом. Уступить дорогу при наличии препятствия на уклонах, обозначенных знаками 1.13 и 1.14 , должен водитель ТС, движущегося на спуск.

1.15 Скользкая дорога Подробнее
Описание знака

Машина виляет в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги с повышенной скользкостью проезжей части. Участок дороги с повышенной скользкостью проезжей части. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

В целях предотвращения заноса на участках, обозначенных знаком, необходимо двигаться с пониженной скоростью, без резких ускорений и торможений, плавно вращая рулевое колесо, так как коэффициент сцепления шин с покрытием в силу обстоятельств очень мал. Желтый фон на знаках 1.15 установленных в местах производства дорожных работ, означает, что эти знаки являются временными. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.16 Неровная дорога Подробнее
Описание знака

Кочки в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги, имеющий неровности на проезжей части (волнистость, выбоины, неплавные сопряжения с мостами и тому подобное). Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Во избежание потери управления и устойчивости двигаться на таких участках следует с пониженной скоростью. Желтый фон на знаке 1.16 установленных в местах производства дорожных работ, означает, что эти знаки являются временными. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.17 Искусственная неровность Подробнее
Описание знака

Кочка в белом треугольнике с красной окантовкой

Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Такая искусственная неровность водителями называется «лежачий полицейский».

1.18 Выброс гравия Подробнее
Описание знака

Камни из под колес в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги, на котором возможен выброс гравия, щебня и тому подобного из-под колес транспортных средств. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Следует по возможности увеличить интервал и дистанцию между автомобилями, снизить скорость. Если на знаке желтый фон, то знак является временным. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.19 Опасная обочина Подробнее
Описание знака

Камни из под колес в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги, на котором съезд на обочину опасен. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Категорического запрета для съезда на обочину нет. Но если возникла необходимость, то сделайте это крайне осторожно, а на большегрузных автомобилях лучше этого не делать. Если на знаке желтый фон, то знак является временным. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.20.1 Сужение дороги Подробнее
Описание знака

Изогнутые линии в белом треугольнике с красной окантовкой

Сужение дорог осуществляется с обеих сторон Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Приближаясь к сужению дороги, водитель должен снизить скорость и держаться ближе к правому краю проезжей части. Если на знаке желтый фон, то знак является временным. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.20.2 Сужение дороги Подробнее
Описание знака

Прямая и изогнутые черные линии в белом треугольнике с красной окантовкой

Сужение дороги осуществляется справа Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Приближаясь к сужению дороги, водитель должен снизить скорость и держаться ближе к правому краю проезжей части. Если на знаке желтый фон, то знак является временным. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.20.3 Сужение дороги Подробнее
Описание знака

Прямая и изогнутые черные линии в белом треугольнике с красной окантовкой

Сужение дороги осуществляется слева Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Приближаясь к сужению дороги, водитель должен снизить скорость и держаться ближе к правому краю проезжей части. Если на знаке желтый фон, то знак является временным. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.21 Двустороннее движение Подробнее
Описание знака

Черные стрелки в белом треугольнике с красной окантовкой

Начало участка дороги (проезжей части) со встречным движением. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Знак устанавливается перед участком дороги (проезжей части) с встречным движением. Если на знаке желтый фон, то знак является временным. В случаях если значения временных дорожных знаков и стационарных дорожных знаков противоречат друг другу, водители должны руководствоваться временными знаками.

1.22 Пешеходный переход Подробнее
Описание знака

Человек переходит дорогу в белом треугольнике с красной окантовкой

Пешеходный переход, обозначенный знаками 5.19.1, 5.19.2 и (или) разметкой 1.14.1 и 1.14.2 Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Приближаясь к нерегулируемому пешеходному переходу, водитель должен повысить внимание, быть готовым, чтобы снизить скорость или остановиться уступая дорогу пешеходам, переходящим проезжую часть.

1.23 Дети Подробнее
Описание знака

Бегущие люди в белом треугольнике с красной окантовкой

Участок дороги вблизи детского учреждения (школы, оздоровительного лагеря и тому подобного), на проезжей части которого возможно появление детей. Устанавливается в н. п. за 50-100 м, вне н. п. — за 150-300 м, знак может устанавливаться и на ином расстоянии, но при этом расстояние оговаривается таб.8.1.1 «Расстояние до объекта».

Обязательно повторяется вне н.п., при этом второй знак устанавливается на расстоянии не менее 50 м. Знак 1.23 повторяется и в населенных пунктах непосредственно в начале опасного участка. Следует снизить скорость, повысить внимание. Учитывайте, что действия детей неосознанны и не предсказуемы.

1.24 Пересечение с велосипедной дорожкой или велопешеходной дорожкой Подробнее
Описание знака

Велосипед в белом треугольнике с красной окантовкой

Выцвели или нет? • Дни Озёрного

— В нашем городке стоят знаки “Стоянка запрещена” двух видов. Один, как в правилах дорожного движения, — на синем фоне красный крест и ободок. Другой — на синем фоне белый крест и ободок. Соответствует ли знак “Стоянка запрещена” с белым крестом на синем фоне, если его нет в ПДД?
И такой знак не один, поэтому ответ “Выцвели” меня не устраивает. Один знак (белый крест на синем фоне) обновлен совершенно недавно, выглядит замечательно.

Жительница городка

От редакции:
Вместе с начальником отделения ГИБДД ЗАТО Озерный М.В. Прогиным мы проехали по улицам муниципалитета, чтобы найти знаки, о которых пишет читательница. И действительно, в двух местах — на остановке возле дома №10 на улице Московской и возле дома №18 на улице Ленинградской — мы обнаружили дорожные знаки, которые не соответствуют требованиям ГОСТа. Но стоит отметить, что знаки не новые, а просто выцвели. По словам Михаила Вячеславовича, по результатам проведенного рейда по тем знакам, которые установлены с нарушениями требований, дорожным службам Озерного будет выписано предписание по устранению недостатков.
Как нам пояснили в МБУ “Дорсервис”, замена знаков производится в течение года. На данный момент готовятся документы на закупку новых знаков, которые затем установят вместо устаревших. Помимо этого, будут заменены и другие дорожные знаки, поврежденные вандалами.

Дорожный знак 8.5.1 «Субботние, воскресные и праздничные дни»

До сих пор, говоря о знаках дополнительной информации (или табличках), мы отмечали вводимые ими ограничения или дополнения, которые касались расстояния, направления действия или вида транспортного средства.

Иными словами, знаки, установленные с данными табличками, действовали на определенном участке дороги, который характеризовался этими тремя признаками.

Однако Правила предусматривают большую группу табличек, которые ограничивают действие установленных с ними знаков по иному критерию — по времени.

Совсем не трудно догадаться, что данные таблички обозначают определенный период времени —  либо некие дни недели, либо какой-то хронологический промежуток. И знак, установленный с одной из этих табличек, будет действовать только в указанный промежуток времени.

Рассмотрим первую табличку — с «красной снежинкой». Она называется «Субботние, воскресные и праздничные дни» (8.5.1).
Табличка «Красная снежинка», установленная с каким-либо знаком, означает, что данный знак будет «работать» только в выходные (субботние, воскресные) и праздничные дни. И никогда более.

Судя по изображению, въезд на данный участок дороги будет запрещен только в субботу, воскресенье или дни государственных праздников (т.е. праздничных дней, прописанных в Трудовом кодексе РФ). В остальные дни недели (коих, кстати, значительно больше), запрет въезда на указанный участок дороги с данного направления не действует.

Или вот еще один пример.

Комбинация интересующей нас таблички и знака «Парковка (парковочное место)» (6.4) означает, что стоянка на данном участке дороги будет разрешена только в выходные и праздничные дни. В рабочие же дни стоянка здесь не допускается.

Таким образом, знак 8.5.1 «Субботние, воскресные и праздничные дни» («красная снежинка») информирует водителей о том, что действие установленного с ней знака будет распространяться только на конкретный период времени — на нерабочие дни недели.

Если данная информация была для вас полезна, напишите, пожалуйста, об этом в комментариях. Если возникнут вопросы, пишите, обязательно постараюсь вам помочь.

Пдд онлайн от команды autoass!

Содержание статьи:
  • дорожный знак звездочка
  • дорожный знак снежинка
  • дорожный знак звездочка красная
  • дорожный знак красная снежинка на белом фоне
    Метки: cубботние, воскресные и праздничные дни     

Почему дорожные знаки имеют разную форму и цвет?

Первые дорожные указатели появились с возникновением первых дорог. Что бы не заблудиться в пути, древние путешественники надламывали сучья, делали метки на коре, размещали камни разного размера. Когда возникла письменность, на камнях стали писать названия населённых пунктов, в которые вели дороги. Первая система дорожных указателей возникла в Древнем Риме в III в. до н.э. Когда по дорогам стали ездить конные экипажи, была проведена организация дорожного движения. Возникновение первых автомобилей на рубеже XIX-XX веков, потребовало установления предупреждающих дорожных знаков для обеспечения безопасность езды на дороге.

В 1909 году в Париже прошла первая Конференция по дорожному движению, где была разработана и принята «Международная конвенция относительно передвижения автомобилей». Было введено четыре дорожных знака. В 1931 году была принята первая «Конвенция о введении единообразия в сигнализацию на дорогах». Дорожных знаков стало 26, которые разделили на 3 группы: предупреждающие, предписывающие и указательные.

В настоящее время дорожных знаков, которые должен знать водитель насчитывается более 120 штук и количество их групп достигло цифры 8. Все они имеют разный цвет, размер, форму и обозначения. Для лучшей видимости современные указатели раскрашены специальными водостойкими красками со светоотражающими элементами.

Форма знаков зависит от их предписания. К примеру, предупреждающие знаки — треугольники с белым полем, красной каймой и черным изображением. Запрещающие знаки всегда круглые с красной каймой, белым фоном и черным рисунком. Направляющие знаки имеют прямоугольную форму либо форму стрелок. Их цвет зависит от места установки. Синий  располагают на автомагистралях, зеленый – на основных дорогах, белый – на остальных дорогах. Направляющие знаки для грузовых автомобилей представлены как указатели с черным фоном. Знак «Движение без остановки запрещено»  — восьмиугольник. Восьмиугольные знаки в отличие от квадратных знаков могут быть прочитаны с разных направлений.

Стоит заметить, что чем больше сторон у предупреждающего знака, тем аккуратней должен быть водитель, так как такие знаки предупреждают о самой высокой опасности на дорогах. Круглые знаки, у которых стороны и вовсе отсутствуют, говорят о запрете движения в определенную сторону. Нарушение их предписаний может стоить водителю жизни. Треугольные знаки используются для предупреждений. Чаще всего они говорят о сужении дороги, возможном обвале камней или неожиданном появлении животного на пути. В этом случае водитель должен быть особо внимателен, но это не означает, что препятствие будет немедленно встречено на пути.

Предписывающие знаки обычно имеют фон синего цвета. Так в ППД обозначают рекомендацию, но не запрет. Все, что находится внутри круга делать не запрещено, а даже нужно. Дополнительные знаки представлены в форме небольшого горизонтального прямоугольника с белым фоном и черной окантовкой. Они  уточняют или ограничивают действие знаков, с которыми они применены. Такие типы указателей всегда стоят вместе с другими знаками ПДД.

Временные знаки, которые устанавливают на дорогах отличаются от всех остальных своим цветом. Это треугольники и круги с желтым или оранжевым фоном  и красной окантовкой. Чаще всего они обозначают проведение ремонтных работ, которые ограничены по времени.

В целом все знаки оформлены в ярких, удобочитаемых цветовых контрастах и форме, хорошо различимых издалека водителями. Все они имеют стандартную высоту, ширину на основании типа дороги, на котором они будут размещаться. Вы никогда не столкнетесь с дорожным знаком, где буквы будут желтыми на зеленом фоне или с мелкими буквами, не различимыми издалека.

Реклама от Google

Новый пост знак в 1 из


3.17.1 «Таможня»

7 Февраль 2013      Администратор      Главная страница » Дорожные знаки      Просмотров:  

Таможня — место серьезное, где досмотр содержимого багажника, вещей и проверка документов — это неоспоримое право должностных лиц.

Обязанностью водителя и пассажиров, в этом случае, будет непрепятствование исполнению ими своих непосредственных обязанностей.

Дорожный знак «Таможня» служит именно для обозначения этого особенного участка дороги — государственной границы Российской Федерации. Хотя данный знак имеет и международное значение.

Жгучее желание автотуриста выехать за рубеж не должно вступать в противоречие с нормами, предписываемыми знаком.

А требования знака «Таможня» очень просты: водителю запрещается проезд без остановки на таможенном контрольно-пропускном пункте. Необходимо остановиться перед стоп-линией, а при ее отсутствии — не пересекать линию установки данного знака.

Лишь после прохождения всех процедур проверки и только с разрешения работников таможни водителю позволяется продолжить дальнейшее движение в запланированном направлении.  Естественно, при  условии положительного разрешения всех таможенных вопросов.

Согласно ПДД, знак «Таможня» должен устанавливаться и предварительно — на расстоянии 500 метров до контрольно-пропускного пункта таможни.

И будьте уверены, предварительная установка знака существует не для того, чтобы водитель и пассажиры начинали судорожно запрятывать подальше запрещенные к вывозу предметы, а исключительно с целью предупреждения о приближении к особому участку дороги — таможне.

Выполнив все предписанные процедуры, законопослушный водитель обязательно получит разрешение на дальнейшее движение и, возможно, услышит заветную крылатую фразу: «Таможня дает добро!»

Если данная информация была для вас полезна, напишите, пожалуйста, об этом в комментариях. Если возникнут вопросы, пишите, обязательно постараемся вам помочь.

Пдд онлайн от команды autoass!

Содержание статьи:
  • знак таможня
  • знак таможня пдд
  • дорожный знак таможня
  • знак таможни

8.5.1 «Субботние, воскресные и праздничные дни»

9 Май 2013      Администратор      Главная страница » Дорожные знаки      Просмотров:  

До сих пор, говоря о знаках дополнительной информации (или табличках), мы отмечали вводимые ими ограничения или дополнения, которые касались расстояния, направления действия или вида транспортного средства.

Иными словами, знаки, установленные с данными табличками, действовали на определенном участке дороги, который характеризовался этими тремя признаками.

Однако Правила предусматривают большую группу табличек, которые ограничивают действие установленных с ними знаков по иному критерию — по времени.

Совсем не трудно догадаться, что данные таблички обозначают определенный период времени —  либо некие дни недели, либо какой-то хронологический промежуток. И знак, установленный с одной из этих табличек, будет действовать только в указанный промежуток времени.

Рассмотрим первую табличку — с «красной снежинкой». Она называется «Субботние, воскресные и праздничные дни» (8.5.1). Табличка «Красная снежинка», установленная с каким-либо знаком, означает, что данный знак будет «работать» только в выходные (субботние, воскресные) и праздничные дни. И никогда более.

Судя по изображению, въезд на данный участок дороги будет запрещен только в субботу, воскресенье или дни государственных праздников (т.е. праздничных дней, прописанных в Трудовом кодексе РФ). В остальные дни недели (коих, кстати, значительно больше), запрет въезда на указанный участок дороги с данного направления не действует.

Или вот еще один пример.

Комбинация интересующей нас таблички и знака «Парковка (парковочное место)» (6.4) означает, что стоянка на данном участке дороги будет разрешена только в выходные и праздничные дни. В рабочие же дни стоянка здесь не допускается.

Таким образом, знак 8.5.1 «Субботние, воскресные и праздничные дни» («красная снежинка») информирует водителей о том, что действие установленного с ней знака будет распространяться только на конкретный период времени — на нерабочие дни недели.

Если данная информация была для вас полезна, напишите, пожалуйста, об этом в комментариях. Если возникнут вопросы, пишите, обязательно постараюсь вам помочь.

Пдд онлайн от команды autoass!

Содержание статьи:
  • дорожный знак звездочка
  • дорожный знак снежинка
  • дорожный знак звездочка красная
  • дорожный знак красная снежинка на белом фоне
    Метки: cубботние, воскресные и праздничные дни     

8.5.5 «Время действия»

14 Июнь 2015      Администратор      Главная страница » Дорожные знаки      Просмотров:  

Помимо табличек, характеризующих дни недели – 8.5.1, 8.5.2 и 8.5.3, которые мы рассмотрели в предшествующих комментариях, — Правила дорожного движения располагают еще четырьмя знаками дополнительной информации, которые ограничивают действие установленных с ними знаков по времени.

Но уже не по дням недели, а в конкретные часы определенного дня недели.

Все эти таблички носят одно название — «Время действия». Принципы установки и действия всех этих табличек абсолютно аналогичны друг другу, поэтому мы рассмотрим их в одном общем комментарии.

Итак, проанализируем стандартные варианты табличек «Время действия», предложенные ГОСТом.

Табличка 8.5.4 означает, что установленный с ней знак будет регулировать движение в каждый день недели, но с 8.00 до 17.30 (по местному времени).

Табличка 8.5.5 проинформирует водителя о том, что знак, примененный с ней, будет распространять свое действие только в субботний, воскресный или праздничный день в указанное на табличке время.

Табличка 8.5.6 даст понять, что установленный с ней знак будет «работать» только в рабочий день и только с 8.00 до 17.30.

Наконец, табличка 8.5.7 распространит действие установленного с ней знака на каждый понедельник с 8.30 до 9.30.

Давайте рассмотрим конкретный пример.

Судя по дорожной ситуации, представленной знаком «Стоянка запрещена» в сочетании с табличкой «Время действия», на данном участке дороги стоянка транспортных средств будет запрещена только в субботние, воскресные или праздничные дни и только с 8.00 до 17.30. Следовательно, в иное время знак «не работает», и его как бы не существует.

Естественно, вариаций с табличками «Время действия» может быть самое невероятное количество. Они могут быть представлены самыми различными вариантами временных отрезков.

Водителю нужно лишь запомнить принцип работы таблички: она указывает на конкретный промежуток времени, в течение которого и будет действовать установленный с ней знак.

Если данная информация была для вас полезна, напишите, пожалуйста, об этом в комментариях. Если возникнут вопросы, пишите, обязательно постараюсь вам помочь.

Пдд онлайн от команды autoass!

Содержание статьи:
  • знак остановка запрещена с табличкой времени
  • знак стоянка запрещена с табличкой времени
  • знак остановка и стоянка запрещена с табличкой времени
  • знак остановка запрещена с временем внизу

Про знаки дорожного движения, ПДД знаки

Небольшой социологический опрос среди водителей выявил, что самыми любимыми дорожными знаками являются:

Знак 3.31. Конец зоны всех ограничений является любимым у подавляющего большинства российских водителей. Его любят 44% опрошенных. Он снимает ограничения на обгон, максимальную скорость, остановки и стоянки.

Знак 2.1. Главная дорога, который предоставляет право преимущества проезда нерегулируемых перекрестков, нравится 18% водителей.

Знак 3.1. Въезд запрещен, или Кирпич, не смотря на то, что запрещает въезд всех транспортных средств в данном направлении, является любимым у 10% опрошенных.

Знак 7.7. Пункт питания, или попросту Нож с вилкой привлекает внимание у 4% водителей.

Знак 7.12. Пост дорожно-патрульной службы нравится 4% людей.

Знак 4.1.3 Движение налево любят 4% водителей, большинство из которых мужчины.

Знак 7.11. Место отдыха, или Елка с табуреткой вызывает приятные впечатления у 3% водителей.

Знак 3.21 Конец зоны запрещения обгона, или Обгон разрешен обожают 3% всех опрошенных.

Знак 2.5 Движение без остановки запрещено, или знак Стоп находит поддержку у 2% людей, видимо из-за своей необычной формы.

Среди остальных знаков, набравших маленькое число голосов, водители с теплом в душе упоминали знаки с паровозами, оленями, коровами и другими веселыми картинками.

Почему знак Стоп имеет форму восьмиугольника?

Знаки Стоп и Уступи дорогу имеют свою неповторимую форму. Один сделан в форме восьмиугольника, а другой в форме перевернутого треугольника. Они не похожи ни на один другой знак, в то время как большинство знаков разделено по категориям и похожи между собой.

Такая форма знаков Стоп и Уступи дорогу связана с их особым значением. В условиях плохой видимости, например, снегопада, когда знак может быть залеплен снегом, эти знаки можно узнать издалека. Кроме того, водителям со встречного направления даже с обратной стороны понятно, какой знак стоит на дороге.

Забавные знаки ПДД

Помимо нелогичной расстановки дорожных знаков на трассе, когда на одном столбе могут оказаться две противоположных по значению таблички, например, Главная дорога и Уступи дорогу, бывают и откровенно смешные дорожные знаки. Особенно необычными выглядят дорожные знаки в других странах, хотя для местного населения они кажутся совершенно привычными.

Есть ли в Аризоне зомби, не известно, во всяком случае, в местную полицию таких сообщений не поступало, но знак на всякий случай поставили.

Никогда так не делай!- гласит немецкая предупреждающая табличка на дороге. Иначе дно башка попадешь совсем мертвый будешь.

Для многочисленных туристов крымские власти разработали новый дорожный знак, показывающий не только направление движения к ближайшему населенному пункту, но и к ближайшему ларьку.

Чисто русский знак Кирпич, трехмерный для большей наглядности.

Иногда обилие дорожных знаков на дороге не помогает водителю, а наоборот, может ввести в полное замешательство.

Скачать бесплатно | Красный Крест, Звездочка, Символ, Примечание, Стрелка, Знак, Круг PNG

Скачать бесплатно | Красный Крест, Звездочка, Символ, Примечание, Стрелка, Знак, Круг PNG | HiClipart

Размеры картинки: 614x613px

Красный Крест, Звездочка, Символ, Примечание, Стрелка, Знак, Круг PNG

Нажмите CAPTCHA выше и загрузите PNG

  • красная иллюстрация X, отметка X Галочка, неправильный знак PNG 819x620px Размер файла: 25.77 КБ
  • Галочка Международное движение Красного Креста и Красного Полумесяца Американский Красный Крест, Знак Красного Креста, круглый красный x логотип PNG 720x720px Размер файла: 12,91 КБ
  • Компьютерные иконки Галочка Крест, X PNG 2000x2000px Размер файла: 249,97 КБ
  • red x illustration, Американский Красный Крест, Международное движение Красного Креста и Красного Полумесяца Христианский крест, неправильно PNG 600x592px Размер: 15.38 КБ
  • Нет символа Знак, запрещенные знаки, нет вывесок PNG 588x600px Размер файла: 22,2 КБ
  • изогнутая красная стрелка, кривая стрелка, изогнутые стрелки PNG 1532x1529px 1532x1529px Размер файла: 43,87 КБ
  • крестовая иллюстрация, без символа компьютерные иконки, красный крест PNG 600x600px Размер файла: 8,36 КБ
  • Стрелка Кривая, Стрелка PNG 390x698px 390x698px Размер: 8.38 КБ
  • НЕТ вывесок, знак «Стоп» Без символа Предупреждающий знак Красный, Блокировать знак с PNG 2384x2384px Размер файла: 87,83 КБ
  • Дорожный знак Дорожный знак Направление, положение или указатель, дорога PNG 700x801px 700x801px Размер файла: 403.61 КБ
  • иллюстрация направления красной стрелки, стрелка, стрелка влево HD PNG 1083x816px 1083x816px Размер файла: 28.42 КБ
  • запрещенный логотип, знак без символа, svg PNG 600x600px 600x600px Размер файла: 23 КБ
  • красная х иллюстрация, галочка крест красная галочка, крест PNG 1992x2105px 1992x2105px Размер файла: 278.53 КБ
  • Христианский крест Символ Компьютерные иконки Американский Красный Крест, христианский крест PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 14,51 КБ
  • красный значок кнопки X, значок ошибки HTTP 404, файл Red Cross Mark PNG 640x640px Размер файла: 63,78 КБ
  • коричневая деревянная вывеска на зеленой траве, знак дерева, знак травы PNG 720x1081px 720x1081px Размер файла: 873.2KB
  • нет знака, Дорожный знак Стоп, Красный Крест PNG 600x600px Размер: 24.51 КБ
  • Стрелка, красная стрелка PNG 2304x1296px Размер файла: 150,2 КБ
  • красная стрелка вниз, символ стрелки, нижняя правая стрелка PNG 720x667px 720x667px Размер файла: 86,66 КБ
  • Стрелка, красная стрелка вправо, красная стрелка PNG 6135x5071px 6135x5071px Размер файла: 397.61 КБ
  • Кнопка значки компьютеров меню «Пуск», стоп PNG 600x600px Размер: 54.02 КБ
  • иллюстрация красного креста, больница Знаки плюс и минус Символ + Американский Красный Крест, красный крест PNG 1280x1280px Размер файла: 3,53 КБ
  • черная стрелка вниз, Тайваньская стрелка, стрелка вниз PNG 1242x2853px 1242x2853px Размер файла: 159,77 КБ
  • Icon Arrow Масштабируемая графика, красная стрелка, логотип с красной стрелкой PNG 8000x4661px 8000x4661px Размер файла: 550.55KB
  • иллюстрация черного креста, иллюстрация креста иллюстрация, крест PNG 545x769px Размер файла: 89.05 КБ
  • первая помощь, больница клиника медицина врач здоровье, красный крест PNG 500x500px Размер файла: 14,84 КБ
  • красные вывески, без символа, запрещено PNG 640x640px Размер файла: 69,42 КБ
  • Arrow Arc, диаграмма со стрелкой Arc, логотип с черной стрелкой PNG 2180x913px Размер файла: 32,08 КБ
  • красная буква X, Международное движение Красного Креста и Красного Полумесяца Символ американского Красного Креста, 4 PNG 700x800px Размер: 36.67 КБ
  • Въезд запрещен, Дорожные знаки в Сингапуре Дорожный знак Знак «Стоп» Одностороннее движение, Дорожный знак PNG 1024x1024px Размер файла: 56,75 КБ
  • иллюстрация со стрелкой влево и вправо, декабрь октябрь январь сентябрь, изысканные деревянные знаки со стрелкой PNG 2048x2216px 2048x2216px Размер файла: 414,8 КБ
  • три красные стрелки, стрелка прозрачность и прозрачность, обтекаемая стрелка PNG 1874x2449px Размер файла: 130.54 КБ
  • логотип Красного Креста, логотип американского Красного Креста, скорая помощь PNG 1024x1024px 1024x1024px Размер файла: 64,54 КБ
  • иллюстрация красного креста, знаки плюс и минус Компьютерные иконки, знак плюс PNG 582x598px Размер файла: 7,21 КБ
  • Символ компьютерных иконок Американского Красного Креста, Добавить материал кнопки PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 6,1 КБ
  • Музыкальная нота Музыкальная нотация, музыкальная нота PNG 592x1024px 592x1024px Размер файла: 271.55 КБ
  • знак остановки, дорожный знак без символа эмодзи предупреждающий знак, запрещено PNG 1024x1024px 1024x1024px Размер файла: 42,55 КБ
  • Красный Крест, Символ, Логотип, Больница, Знаки плюс и минус, Линия, Текст, Площадь PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 19,04 КБ
  • Компьютерные иконки Знаки плюс и минус, дополнение PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 4,14 КБ
  • черная стрелка вверх, символ стрелки на рабочем столе, стрелка вверх PNG 1600x1600px Размер: 16.36 КБ
  • Стрелка Компьютерные Иконки, стрелки PNG 1024x536px 1024x536px Размер файла: 3,57 КБ
  • Кривая стрелки, изогнутые стрелки PNG 800x401px Размер файла: 58.18 КБ
  • красный логотип X, значок знака умножения символов, кнопка «Отмена» PNG 2000x2000px 2000x2000px Размер файла: 450.83KB
  • Больница Американского Красного Креста Христианский крест, Красный Крест PNG 600x551px Размер: 32.51 КБ
  • Компьютерные иконки Зеленая стрелка Arrowhead, красная стрелка PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 36,89 КБ
  • Компьютерные иконки со стрелкой, красная стрелка влево, изогнутая, иллюстрация с красной стрелкой PNG 600x529px 600x529px Размер файла: 15.01 КБ
  • красная буква x, знак умножения Служба либерализации энергетики, Красный Крест PNG 800x800px Размер файла: 8,99 КБ
  • Стоп знак графика Иллюстрация Символ, знак стоп PNG 649x630px Размер: 56.51 КБ
  • белая и черная стрелка вправо, значок стрелки, стрелка вправо PNG 720x406px 720x406px Размер файла: 49,81 КБ
  • Стрелка Компьютерные Иконки, Стрелка PNG 512x512px Размер файла: 205.03 КБ
  • Дорожный знак Дорога, Деревянные стрелки указывают PNG 1200x1200px 1200x1200px Размер файла: 609.42 КБ
  • Музыкальная нота Clef, Notes PNG 768x1328px Размер файла: 415.1 КБ
  • Рисунок Стрелка, петля стрелка PNG 670x702px Размер файла: 16,4 КБ
  • иллюстрация с двумя зелеными галочками и двумя красными отметками x, иллюстрация с галочкой X, знак красной вилки на крючке PNG 1024x1024px 1024x1024px Размер файла: 320.05 КБ
  • иллюстрация черной стрелки, стрелка, дуговая стрелка PNG 1852x1840px 1852x1840px Размер файла: 49.21 КБ
  • иллюстрация красной стрелки, рисованная стрелка PNG 1136x2524px 1136x2524px Размер файла: 70.94 КБ
  • Знак процента Символ процента Амперсанд Соотношение, символ PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 235.66 КБ
  • Стрелка Бесплатный контент Веб-сайт, Зеленая стрелка влево PNG 600x457px 600x457px Размер файла: 18,2 КБ
  • коричневый Новинка! логотип, наклейка с биркой, новая круглая бирка PNG 1578x1563px Размер файла: 174.87KB
  • иллюстрация музыкальной ноты, музыкальная нота, музыкальная нота PNG 924x864px Размер файла: 234.86 КБ
  • Отдых Нотная запись Целая нота Музыкальная нота, музыкальная нота PNG 512x512px 512x512px Размер файла: 6,13 КБ
  • Знак меньше чем Математика Знак больше Символ Знак равенства, Математика PNG 512x512px Размер файла: 5,2 КБ
  • галочка и X иллюстрация, галочка дизайн иконок значок, галочки PNG 8000x3974px Размер файла: 1,87 МБ
  • красный X, значки компьютеров East River Shorewalkers Inc X отметка Галочка, неправильная отметка PNG 2000x1414px 2000x1414px Размер файла: 59.21 КБ
  • Восьмая нота Знак повторения луча Музыкальная нота Четвертная нота, музыкальная нота PNG 1538x1750px Размер файла: 24,57 КБ
  • красный логотип кандзи, религиозный символ, религия, свастика, Саравати PNG 512x512px Размер файла: 4,68 КБ
  • Золото, лента, иллюстрация желтой ленты PNG 567x623px Размер файла: 173.04 КБ
  • Целая нота Восьмая нота Музыкальная нота Четвертная нота, музыкальная нота PNG 800x800px Размер: 8.71 КБ
  • иллюстрация разноцветной шестерни, иллюстрация шестерни, элемент PPT, информация PNG 783x688px 783x688px Размер файла: 352 КБ
  • Компьютерные иконки Кнопка Play Android, игра PNG 530x530px Размер файла: 49,29 КБ
  • Значок X, Американский Красный Крест, Международное движение Красного Креста и Красного Полумесяца, Красный Крест PNG 600x592px Размер файла: 16,46 КБ
  • иллюстрация золотого ключа g, музыкальная нота Staff Clef, музыкальный PNG 1313x2270px Размер файла: 631.04 КБ
  • Музыкальная нота Рабочий стол, музыкальный PNG 1354x2342px Размер файла: 482.12 КБ
  • Без символа Знак, знак остановки PNG 800x800px 800x800px Размер файла: 20,33 КБ
  • Логотип Line Angle Brand, красная стрелка вправо, вывеска с красной стрелкой PNG 6304x3406px 6304x3406px Размер файла: 308.32 КБ
Загрузить больше PNG

Мы используем файлы cookie для анализа нашего трафика и улучшения предоставляемых нами услуг. Продолжая использовать этот веб-сайт, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie, как это определено в нашей политике конфиденциальности.принимать

Пять звезд, но со звездочкой — Обзор Lahaina Pali Trail, Lahaina, HI

Как добраться: точка местоположения в Trip Advisor совершенно неверна и приводит вас в частную собственность на Prison St к северу от шоссе 30, с голодными собаками, напрягающимися на своих цепях. Западная тропа фактически находится в 10 милях к югу от Лахайны и в 3 милях к западу от гавани Маалаи. Парковка находится на северной стороне шоссе 30 в ущелье Манаваипуэо, примерно в 0,25 мили к северу от туннеля Пали.Там нет дорожного знака, но ищите открытую красную грунтовую парковку, и начало тропы находится прямо там (ссылки на ворота относятся к восточной части тропы).

Тропа пересекает горы и поднимается на линию ветряных мельниц высотой 1600 футов. Доступ к нему можно получить с востока или запада, и его длина составляет 5,5 миль. И восточная, и западная тропа доступны с шоссе 30. Мы вошли с западной тропы.

* Звездочка — Путь представляет собой крутой и устойчивый подъем, 2,6 мили по старой тропе Лахайны к вершине горы.Он каменистый и требует осторожности. Очень легко подвернуть ногу. Я бы порекомендовал как минимум приличную туристическую обувь или хорошие кроссовки. На узких тропах много серпантинов и крутых обрывов. У меня около часа 15 минут в одну сторону.

Хорошая тренировка. Я в довольно хорошей форме, и я тяжело дышал. Не легче возвращаться вниз, потому что опора такая рискованная. Безумие думать, что когда-то по этой дороге ездили кареты. Было бы не менее безумно брать с собой в этот поход маленьких детей.Один промах и долгое падение может закончиться.

Выигрыш: потрясающие виды. Каждый поворот приносит новую перспективу. Мы наблюдали за серферами далеко внизу. Ланай и Кахулаве вырисовываются вдалеке. Зимой можно увидеть китов. Даже сам склон горы прекрасен: невысокий густой кустарник, красная глина и вулканическая порода, корявые низкие деревья бансай, упрямо цепляющиеся за склон утеса. Вид наверху, где стоят ветряные мельницы, особенно захватывает дух.

Выехали в 7 утра. Это хорошее время, чтобы пойти.До самого спуска мы никого не встретили. Это было такое тихое и спокойное начало дня. Ты можешь вернуться в 9:30 и пойти позавтракать. Может быть жарко, но день был пасмурный, изредка моросил дождь, так что это не напрягало. Мне нужно было всего около 8 унций воды, но в жаркий день мне понадобится больше. А на обратном пути было приятно остановиться у ларька с соками!

GBN Подкаст: Уборка дома для бейсбола WVU

Команда Рэнди Мейзи выиграла пять из своих первых шести игр в «Большой двенадцати» после завершения своего первого розыгрыша в лиге с 2016 года.По итогам уик-энда «альпинисты» находятся на первом месте, но с небольшой звездочкой. Правый полевой игрок Остин Дэвис разгромил нападение WVU с позиции лидера, забив восемь попаданий за три игры, в то время как нападение Mountaineer нанесло 22 удара по Baylor Bears в Моргантауне. Однако с другой стороны вырисовывается тяжелое испытание, поскольку 10 лучших ковбоев штата Оклахома едут в Моргантаун. В последнем выпуске подкаста «Золотая и синяя нация» Райан Декер и Сэм Конильо разбирают все три игры зачистки WVU над Бэйлором и смотрят на состояние команды, когда она вступает во вторую половину своего сезона. Gold and Blue Nation — местный лидер спортивных новостей Mountaineer, который обеспечивает всестороннее освещение на телевидении и в Интернете. Загрузите бесплатное приложение Gold и Blue Nation через предпочитаемый вами магазин приложений, чтобы всегда быть на расстоянии одного прикосновения от наших спортивных репортажей, основных моментов и архивных передач WVU.

Команда Рэнди Мейзи выиграла пять из своих первых шести игр в «Большой 12» после завершения своего первого розыгрыша в лиге с 2016 года. После выходных «Альпинисты» находятся на первом месте, но с небольшой звездочкой.

Правый полевой игрок Остин Дэвис разгромил нападение WVU с первого места, забив восемь попаданий за три игры, а нападение Mountaineer нанесло 22 удара по Baylor Bears в Моргантауне. Однако с другой стороны вырисовывается тяжелое испытание, поскольку 10 лучших ковбоев штата Оклахома едут в Моргантаун.

В последнем выпуске подкаста «Золотая и синяя нация» Райан Декер и Сэм Конильо разбирают все три игры победы WVU над Бэйлором и смотрят на состояние команды, которая вступает во вторую половину сезона.

Gold and Blue Nation — местный лидер спортивных новостей Mountaineer, предоставляющий всестороннее освещение на телевидении и в Интернете. Загрузите бесплатное приложение Gold и Blue Nation через предпочитаемый вами магазин приложений, чтобы всегда быть на расстоянии одного прикосновения от наших спортивных репортажей, основных моментов и архивных передач WVU.

Обновление

Guangdong COVID-19 и что делать, если вы получили желтый код — это Гуанчжоу

Провинция Гуандун сообщила о 31 новом случае COVID-19, девять из которых протекают бессимптомно, согласно официальным данным за вторник, 12 апреля, которые были опубликованы в эту среду утром.

В случае желтого кода здоровья в Кодексе Юэканг провинции Гуандун указано, что необходимо принять следующие три меры.

1. Немедленно сообщите о своем желтом коде местному сообществу.

2. Изолируйтесь дома и следите за своим здоровьем, не выходите из дома без крайней необходимости.

3. Пройдите тест на COVID-19 в первый, третий и седьмой дни на станции тестирования, предназначенной для лиц с желтым кодом.

Гуанчжоу 

Двадцать два подтвержденных случая заражения Гуандун находятся в Гуанчжоу, два из которых классифицируются как бессимптомные.

Число случаев заболевания уменьшилось на 16 по сравнению с 38, зарегистрированными вчера, и все новые случаи заражения в городе зарегистрированы в районе Байюнь.

Уменьшение числа и тот факт, что все новые пациенты только в районе Байюнь, могут сигнализировать о том, что распространение вируса находится под контролем.

Один из ранее подтвержденных случаев в районе Хайчжу работает в Парке оригинальности Цзин Е на улице Наньчжоу.

Все лица, посетившие первый этаж района с 23 марта по 10 апреля, должны изолироваться дома, сообщить в местное сообщество и сообщить о своем посещении по телефону 020-66850121 или 020-66850128.

Район Наньша ввел «политику только входа» в следующих пяти местах:

Районы Цзэнчэн и Конхуа закрыли все места отдыха, в том числе; интернет-кафе, кинотеатры, музеи и рестораны с 13 по 17 апреля.

Всего в городе приостановлено движение на 12 станциях метрополитена. К ним относятся:

  • Line 2: Line 2: Sanyuanli, Feixiang Park, Baiyun Park, Baiyun Cultural Plaza, Jiangxia

  • 21 Line 8:

    Shangbu, Julong, Shitan, XiaOping

  • линия 3: Datang

  • Guangfo Line: Lijiao

  • Guangfo Line and Line 2: Nanzhou

На пресс-конференции в Гуанчжоу 19 тестов с 9 апреля рискуют стать желтыми.

Наконец, в городе есть три района, отнесенных к категории среднего риска (все в районе Байюнь): Suan Yuan Li, Dilu Bar и Huangxia Light Building Materials City, 488 Huangshi East Road, Haungstone Street.

Шэньчжэнь

В Шэньчжэне были обнаружены два симптоматических и три бессимптомных случая, все из которых прибыли в Шэньчжэнь из других провинций.

Все заболевшие уже переданы в городскую Третью народную больницу для карантина и лечения.

В настоящее время в Шэньчжэне нет зон среднего или высокого риска, но следующее здание было классифицировано как зона блокировки: CITIC Haikuo Tiankong Yaju Building D.

Zhuhai

Компания Zhuhai расширила свою политику, заявив, что весь персонал (кроме учащихся начальной и средней школы и детей) должен предъявить отрицательный результат теста на нуклеиновую кислоту, взятый в течение 48 часов, для входа в определенные места.

Политика действует до полуночи 16 апреля. 

Первоначально она действовала с полудня 10 апреля до полуночи 13 апреля. 

Тест необходим для входа в супермаркеты, рынки, места культуры и развлечений, в общественных местах, жилых районах и при проезде в общественном транспорте.

Людям со звездочкой и/или красным или желтым кодом здоровья не разрешается пользоваться общественным транспортом.

Фошань

Фошань сообщил о трех бессимптомных пациентах.

С вечера вторника любой человек, покидающий Фошань, должен предоставить отрицательный результат теста на нуклеиновую кислоту, сделанный в течение 48 часов до отъезда.

В настоящее время в Фошане нет зон среднего и высокого риска.

Дунгуань

В городе Дунгуань подтвержден один бессимптомный случай.

В настоящее время в Дунгуане нет зон среднего и высокого риска.


[Изображение на обложке через [email protected] -K-ON-G ]

Future Bulldog Райан Фирпо выиграл 75-й ежегодный Мемориал Лена Росса в плей-офф

75-й ежегодный Мемориал Лена Росса завершился турниром по гольфу. Загородный клуб Fort Washington, в котором участвуют десятки лучших юных игроков в гольф со всего штата.

Играя на тех же футболках, что и самые старшие мальчики, Айден Файнаут (мальчики возрастной группы 13-14 лет) угрожал завоевать титул чемпиона. Уроженец Фресно попал в лунку в одну среду на 8-й лунке пар 3 на поле для гольфа Riverside, что помогло ему финишировать с -1 за четыре дня.


75-й ежегодный турнир по гольфу Мемориала Лена Росса подходит к концу в Fort Washington CC. Абсолютным победителем среди мальчиков стал Райан Фирпо из штата Фресно (выиграл в плей-офф). Абсолютным победителем среди девушек стала Астериск Тэлли. Савантские вещи от 12-летнего уроженца Чоучиллы. @ABC30 pic.twitter.com/yCpaU9qobI

— Стивен Хикс (@StephenABC30) 14 апреля 2022 г.

Райан Фирпо, представитель штата Фресно и юниор из Дэвиса, также завершил турнир с -1, отправив Фирпо и Файнаута в плей-офф.

«Просто попробуй попасть в бомбу, а затем оттуда подняться и опуститься с 40 ярдов, так что это было здорово», — сказал Фирпо после того, как сделал птичку на первой лунке плей-офф.

Раунды 66 (Airways), 79 (Саннисайд), 67 (Риверсайд) и 72 (Форт Вашингтон) помогли Фирпо одержать победу, что делает его последовательным выигрышем для коммитов Bulldog после того, как первокурсник FS Джейк Беттенкурт взял корону в прошлом году.

«Это была хорошая неделя, я упорно боролся и счастлив победить в плей-офф», — сказал Фирпо в интервью Action News.

Вунниса Ву выглядела повторной чемпионкой среди девушек после раундов 67, 76, 74 и 70 (E), но другая девушка, игравшая на тех же футболках, пришла к победе из младшей возрастной группы.

13-летняя Астериск Тэлли, только что приехавшая в Огасту Нэшнл на соревнования по драйву, чип-энд-патту, побеждает в общем зачете с результатом -3 благодаря раундам 69, 72, 73 и 70.


СТИПЕНДИЯ ТАЙЛЕРА ЗАЕНТЦА

Второй год подряд семья покойного Тайлера Зэнца была рядом, чтобы вручить стипендию за спортивное мастерство в его память.Выпускник школы Фресно-христианин неожиданно скончался в возрасте 26 лет.

Лиза Шиммон получила стипендию в размере 2000 долларов для девочек, а трое мальчиков получили домой стипендию в размере 1000 долларов для колледжа.

Copyright © 2022 КФСН-ТВ. Все права защищены.

Кэм Янг превращает Masters MC в позитив, прямая честность HV3 и атмосфера Harbour Town остаются безупречными | Новости гольфа и туристическая информация

Часто, особенно в букмекерских конторах, мы предполагаем, что промах на предыдущей неделе означает, что у игрока проблемы.Часто это глупое предположение.

Показательный пример: Кэмерон Янг, который пропустил два из трех своих последних сокращений, включая «Мастерс», затем сразу же забил в первом раунде восемь до 64 лет в четверг на «РБК Наследие». Откуда это взялось после того, как он так плохо играл, спросите вы? Что ж, первый МС пришел на пострадавших от непогоды Players, а второй — на Augusta National… на первом в карьере Янга Masters. Возможно, мы должны были оставить это без внимания.

Конечно, были и другие причины не радоваться Янгу, например, тот факт, что он никогда не играл в Харбор-Тауне как профессионал, и тот факт, что последние три старта он на самом деле не блистал. Но благодаря дополнительному выходному из-за того, что он пропустил выходные в Огаста Нэшнл, он смог добраться до Хилтон-Хед пораньше и осмотреть все поле для гольфа, а также сделать несколько исправлений. Клиника превращения промаха в положительный результат.

«В прошлые выходные у меня была хорошая пара выходных, так что мы приехали сюда, и я играл в понедельник утром», — сказал Янг.«Сыграл на всех 18 лунках, что, на мой взгляд, было неплохо, потому что я успел увидеть их все и как бы подумать об этом за пару дней до того, как мне действительно пришлось играть. В то время как обычно вам повезло увидеть все 18 лунок ко вторнику. днём. Трудно найти правильный баланс между подготовкой и поддержанием свежести. Я думаю, что эта неделя была немного — честно говоря, я хотел сыграть в прошлые выходные, но с точки зрения этой недели это не конец света. У меня была пара дней, чтобы потренироваться, и я приехал сюда немного раньше.»

Вся дополнительная подготовка принесла хорошие результаты в четверг, когда Янг набрал более 3,5 ударов на подходе и 5,792 удара с ти до грина. Впечатляющие вещи от «бомбардировщика» на курсе, требующие точности и точности.

«Это действительно хорошая смесь», — сказал Янг о драгоценном камне Пита Дая. «Есть несколько лунок размером 480. Есть пара длинных лунок пар 5, но есть и такие лунки, где нужно сделать действительно умный удар с ти.Так что я думаю, что это забавное сочетание отверстий.

«Нельзя передвигаться там, не подумав наверняка. Я думаю, очень важна подготовка к большому количеству ударов с ти. места, где вы думаете, что можете быть немного агрессивным, и места, где вы просто не можете».

Через один раунд Янг опережает Хоакина Ниманна на два. Вот все, что вы пропустили в первый день в Хилтон-Хед.

Прямолинейная честность Гарольда Варнера III

На PGA Tour полно парней, которые мало что дают после раунда. Они повторяют одно и то же: «Я отлично бью по мячу», «делаю один удар за раз», «не забегаю слишком далеко вперед» неделю за неделей. А еще есть такие парни, как Гарольд Варнер III, которые в 99,9% случаев говорят именно то, что думают, что иногда может доставить вам неприятности.

К счастью для HV3, это не тот случай. Тем не менее, его прямолинейная честность стала забавной цитатой в четверг, когда Варнеру довелось сыграть вместе с Морганом Хоффманном в первом раунде своего возвращения на PGA Tour. Варнера, начавшего игру с четверки меньше 67, спросили, не заметил ли он каких-либо изменений в свинге Хоффмана с тех пор, как в последний раз видел его много лет назад.

— Я этого не делал, — сказал Варнер. «Но я не очень осведомленный человек, никогда им не был.Я здесь, чтобы победить Моргана. Мне все равно — я понимаю, что он прошел через многое, но каждый на этой планете через что-то пройдет, и это его битва. Моя битва может произойти позже. Когда вы на поле для гольфа, пришло время соревноваться. Я хочу победить. Я не знаю. Это немного сумбурно, но это то, что есть.»

Конечно, Варнер и Хоффманн делал комплименты. Это не было полной дикостью.

«Он по-прежнему хорош в гольфе.Это как кататься на велосипеде. Очевидно, потребуется некоторое время, чтобы избавиться от ржавчины, но просто приятно его видеть. В последний раз я видел его, наверное, три года назад здесь. Мы играли вместе, и он хотел полететь и посмотреть, как играют «Трости» (НХЛ), а затем вернуться и сыграть раунд. Я такой: «Нет, я хороший человек». »

В четверг состоится игра «Каролина Харрикейнз», хотя мы сомневаемся, что этим двоим понравится. Хоффманн просто в восторге от того, что снова может вернуться в тур, а Варнер, ну, ему нужно выиграть турнир.

Вибрация Harbour Town остается безупречной

Это, наверное, можно отнести в кабинет само собой разумеющихся вещей, но этого недостаточно. Просто нет более прохладного события и места, чем RBC Heritage каждый год в рамках PGA Tour. Это можно увидеть по телевидению и, конечно же, увидеть, когда ты там. От того факта, что это место сразу после напряженного турнира Masters, до того, что оно находится в стране пика южного гостеприимства, до того факта, что это просто потрясающее место, где можно расслабиться и отдохнуть, трудно придумать лучшее место для небольшого турнира по гольфу.

«Мне нравится здешний остров, — сказал Грэм Макдауэлл, начавший игру с пятью игроками до 66 лет. — Особенно в те годы, когда я играл там на спине Августы, и я приезжал сюда через неделю. всегда был такой декомпрессионный. Это всегда было такое большое событие, но оно отличалось от того, из которого вы только что вышли. Вы просто вышли из амфитеатра на феноменальное поле для гольфа, где люди просто рады вас видеть.

«Отличная еда, хорошее гостеприимство.На этой неделе со мной семья, и это круто. Последние несколько лет мы мало ездили всей семьей на турниры по гольфу. Гоняться за детьми по дому по вечерам и отвлекать меня приятно, и я очень хорошо отвлекаюсь от гольфа и сохраняю свежесть.»

Шейн Лоури, который претендовал на большую часть Masters, не мог не согласиться.

«То, как устроена трасса, мне нравится держать мяч под деревьями, — сказал Лоури.«Я думаю, что это подходит. Вам нужно как бы летать на нем здесь, и это то, что я хорошо делаю, удерживая его от ветра. , там много ветра. Вам просто нужно контролировать свой мяч, и сегодня я отлично с этим справился. Мне просто нравится приходить сюда

«Честно говоря, это больше связано со временем года. Это, безусловно, красивое место, и это хорошая трасса и все такое, но неделя после мастеров, последняя неделя такая напряженная, и у всех здесь есть свои семьи, и это чувствуется. почти как полуотпуск, и вы просто идете и немного играете в гольф.»

Новый слоган «Наследие РБК» — полупраздник, когда вы еще и немного играете в гольф.

Похмелье Мастеров очень реально (для некоторых)

Честно говоря, было бы еще более удивительно, если бы Кэмерон Смит хорошо сыграл в четверг после жестокого воскресенья в Огаста Нэшнл, которое должно было быть морально и физически истощено. Его бросок на два больше 73 не был таким уж шокирующим, хотя он забил на два меньше 33 в задней девятке.Тем не менее, никто не станет винить его, если завтра он катапультируется и получит заслуженный отдых.

Другие, страдающие от хандры после Masters, включают Дастина Джонсона, который открылся с 1 больше 72 в своем родном штате. Джастину Томасу удалось забить один мяч до 70, несмотря на некоторую шаткую игру вне игры, как и Коллину Морикаве. Однако не все чувствовали последствия прошлой недели. Патрик Кэнтлей забросил пятерку до 66, Хоакин Ниманн забил шесть до 65, а Кори Коннерс забил пятерку до 66 с попаданием в одну дырку на седьмом пар-3.

Анеуплоидия влияет на профили экспрессии генов в штаммах Saccharomyces pastorianus группы I и II во время ферментации

Abstract

Лагерные дрожжи, Saccharomyces pastorianus , представляют собой гибриды Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces eubayanus и делятся на две большие группы, группу I и группу II. Эти две группы произошли, по крайней мере, от одного общего события гибридизации, но впоследствии разошлись, и штаммы Группы I потеряли много S . cerevisiae хромосом, в то время как штаммы группы II сохраняют оба субгенома. Сложные геномы, содержащие ортологичные аллели из родительских хромосом, ставят интересные вопросы, касающиеся регуляции генов и ее влияния на ферментационные свойства штаммов. На наличие ортологичных аллелей накладываются сложности дозировки генов из-за анеуплоидной природы геномов. Мы рассмотрели вклад S . cerevisiae и S . аллелей eubayanus к паттернам экспрессии генов репрезентативных штаммов групп I и II во время ферментации. Мы показываем, что относительное выражение S . cerevisiae и S . ортологов eubayanus положительно коррелируют с числом копий гена. Несмотря на уменьшенный S . cerevisiae в штамме группы I, S . Ортологи cerevisiae вносят вклад в активацию биохимических путей во время ферментации, что может объяснить сохранение специфических хромосом в штамме.И наоборот, S . генов eubayanus значительно перепредставлены в усиленном генофонде штамма группы II. Сравнение профилей транскрипции штаммов во время ферментации выявило как общие, так и уникальные паттерны экспрессии генов, при этом число копий гена является доминирующим фактором. Таким образом, анеуплоидные геномы создают сложные паттерны экспрессии генов во время ферментации, причем дозировка генов играет решающую роль как внутри штаммов, так и между ними.

Резюме автора

Saccharomyces pastorianus — дрожжи, используемые для приготовления лагерного пива, и представляют собой естественные гибриды двух других дрожжей, Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces eubayanus . Гибриды образовались всего 500–600 лет назад, и объединенные родительские геномы ответственны за чистый свежий вкус, характерный для светлого пива. Существует два типа лагерных дрожжей: Штаммы группы I потеряли значительную часть S . cerevisiae хромосом, в то время как штаммы группы II содержат полные S . cerevisiae комплемент. Оба содержат полный набор S . эубаянус хромосом. Необычным последствием гибридизации является то, что геномы лагерных дрожжей являются анеуплоидными с числом копий хромосом в диапазоне от 1 до 6. Анеуплоидия часто связана с раком у людей, поэтому понимание того, как анеуплоидия способствует экспрессии генов у лагерных дрожжей, может дать представление о ее роли в опухолевых клетках.Здесь мы показываем, что на паттерны экспрессии генов влияет хромосомная анеуплоидия, при этом уровни транскриптов напрямую коррелируют с дозировкой генов. Мы также исследовали роль, которую играют родительские геномы в профилях экспрессии генов в условиях ферментации, и показали, что хотя оба генома вносят вклад в пулы транскриптов, S . генов eubayanus чрезмерно представлены во время ферментации.

Образец цитирования: de la Cerda-Garcia Caro R, Hokamp K, Roche F, Thompson G, Timouma S, Delneri D, et al.(2022) Анеуплоидия влияет на профили экспрессии генов в штаммах Saccharomyces pastorianus группы I и II во время ферментации. PLoS Genet 18(4): е1010149. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149

Редактор: Justin C. Fay, Университет Рочестера, США

Получено: 3 декабря 2021 г.; Принято: 15 марта 2022 г .; Опубликовано: 7 апреля 2022 г.

Авторское право: © 2022 de la Cerda-Garcia Caro et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные, лежащие в основе результатов, доступны в виде файлов дополнительных материалов и вспомогательной информации. WGS доступны на https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA810967 Данные RNAseq доступны на https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE197654.

Финансирование: RC и ST были поддержаны Horizon 2020 Европейского Союза, Программа инновационных обучающих сетей Марии Склодовской-Кюри, Project Aromagenesis (номер гранта 76436), https://ec.europa.eu/research/mariecurieactions/actions/ докторские сети. Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Дрожжи, используемые в производстве светлого пива, давно признаны уникальными и отличными от дрожжей, используемых для приготовления эля [1]. В 1870 году, в знак признания их уникальных физиологических качеств, эта группа дрожжей была отнесена Максом Риссом к таксономической классификации Saccharomyces pastorianus [2]. После более чем столетия генетических исследований мы теперь знаем, что S . Штаммы pastorianus являются естественными гибридами Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces eubayanus [3,4].В то время как S . cerevisiae уже давно ассоциируется с производством пива, особенно эля, S . eubayanus был обнаружен только в Патагонии, Южная Америка, в 2011 г. [5]. В то время как Патагония считается основным источником радиации S . eubayanus , естественные изоляты также были обнаружены в Северной Америке, Китае, Тибете и Новой Зеландии, но на сегодняшний день в Европе изолятов не выявлено [6–9] с лишь ограниченными метагеномными доказательствами присутствия этого вида в итальянских Альпах. [10].События гибридизации, в результате которых были получены текущие штаммы S . pastorianus , по оценкам, появился примерно 500–600 лет назад после введения S . eubayanus в Центральную Европу из Китая или Тибета, скорее всего, вдоль торговых путей, таких как Шелковый путь [9]. Унаследованное свойство криоустойчивости от S . Геном eubayanus позволяет S . pastorianus ферментируют при температуре 7–13°C [11].Это свойство вместе с надежной кинетикой брожения унаследовано от S . Геном cerevisiae создал гибридные штаммы дрожжей, способные производить лагер со свежим чистым вкусом, который в настоящее время является самым популярным спиртосодержащим напитком.

Геномный анализ S . pastorianus идентифицировали два различных типа на основе содержания генома и состава хромосом [4,12–17]. Штаммы группы I, или штаммы Saaz, обычно являются триплоидными по содержанию ДНК, сохраняя все родительские S . eubayanus хромосом, но многие S потеряли. cerevisiae хромосом. В эту группу входят несколько штаммов, выделенных из пивоварен Баварии (Германия) и Богемии (Чехия), а также штаммы CBS1538, CBS1513 и CBS1503, первоначально выделенные в лаборатории Carlsberg в конце 19 века [18]. Штаммы группы II, или штаммы Frohberg, включают изоляты из голландских, датских и североамериканских пивоваренных заводов и в основном являются тетраплоидными по содержанию ДНК, содержащей примерно 2n S . cerevisiae и 2n S . Содержание генома eubayanus . Обе группы демонстрируют хромосомную анеуплоидию с числом хромосом от одной до шести [19,20]. Помимо родительских хромосом, S . Штаммы pastorianus содержат несколько гибридных хромосом, содержащих как S . cerevisiae и S . генов eubayanus , возникших в результате рекомбинации в определенных местах между родительскими хромосомами.Некоторые точки разрыва рекомбинации расположены в кодирующих областях, создавая набор гибридных генов, уникальных для лагерных дрожжей [4,12,17,21].

Текущее понимание происхождения и эволюции S основано на анализе генома. pastorianus заключается в том, что штаммы группы I и II произошли от общего события гибридизации между S . eubayanus и S . cerevisiae штаммов для создания гибрида-предшественника.Впоследствии этот штамм-предшественник подвергся второму событию гибридизации со вторым S . cerevisiae для получения штаммов группы II [4,22]. Эта модель поддерживается общими сайтами рекомбинации на гибридных хромосомах, доказательством полиморфизма одиночных нуклеотидов (SNP) в S . cerevisiae штаммов группы II и различия в теломерных участках у штаммов группы I и II [22]. Данные генома также согласуются со сценарием, в котором обе группы возникли в результате единственного события гибридизации между диплоидом S . штамм eubayanus и гетерозиготный штамм S . cerevisiae диплоидный штамм, при этом штаммы группы I испытывают избирательную потерю значительной части гетерогенного S . геном cerevisiae [16,20,23]. Затем обе группы развивались независимо, и каждая из них подвергалась дальнейшим событиям рекомбинации между субгеномами [3,17,20,23]. Обе группы впоследствии разошлись, чтобы создать отдельные подгруппы, каждая со своими уникальными физиологическими и биологическими свойствами.Анализ ферментации штаммов групп I и II показывает, что каждая группа производит характерные ароматические и вкусовые профили [24].

Сложный геном S . pastorianus , содержащий ортологичные аллели, происходящие из разных родительских хромосом, ставит интересные вопросы относительно генной регуляции и ее влияния на ферментационные свойства штаммов. На наличие ортологичных аллелей накладываются сложности дозировки генов из-за анеуплоидной природы геномов.Было показано, что анеуплоидия влияет на паттерны экспрессии генов в эукариотических клетках [25–28]. Присутствие генов-ортологов из двух разных родительских видов Saccharomyces вместе с различиями в количестве копий между ортологами может влиять на клеточный протеом и, в частности, на стехиометрию S . cerevisiae и S . белков eubayanus в составе белковых комплексов [29]. Кроме того, различия в количестве копий генов между штаммами группы I и группы II могут привести к различиям в клеточной физиологии и, следовательно, в свойствах ферментации двух типов S . пасторианус .

Предыдущие анализы транскриптома S . pastorianus в условиях ферментации были ограничены технологией и в основном были сосредоточены на анализе S . cerevisiae генов [30–33]. Такие исследования предшествовали открытию S . eubayanus в качестве родителя S . pastorianus и достижения в технологиях секвенирования РНК [34]. Более поздние исследования транскриптома были сосредоточены на анализе подмножеств генов, играющих специфическую роль в ферментации или в определенных физиологических условиях, таких как хранение в холодильнике или реакция на температуру [35-37].В результате этих исследований были получены важные результаты, касающиеся экспрессии генов, участвующих в утилизации мальтозы, углеводном обмене, мобилизации глицерина, анаэробиозе и биосинтезе белка, что обеспечивает дорожную карту для более подробного анализа транскриптома этих промышленных штаммов.

Здесь мы проанализировали транскриптомы группы I, CBS1538 и группы II, W34/70 S . pastorianus и специально исследовали вклад двух субгеномов в паттерны экспрессии генов в условиях ферментации.Используя секвенирование генома de novo этих штаммов, мы связали паттерны экспрессии генов с количеством копий гена. Мы показываем, что относительное выражение S . cerevisiae и S . ортологов eubayanus прямо коррелирует с числом копий гена в штамме W34/70. Количество копий гена играет меньшую роль в паттернах экспрессии генов в штамме CBS1538, скорее всего, из-за более ограниченной генетической избыточности. Несмотря на уменьшенный S . cerevisiae в штамме CBS1538, S . Ортологи cerevisiae вносят значительный вклад в биохимические пути, активизирующиеся во время ферментации, особенно в метаболизм аминокислот. Наконец, сравнение паттернов транскриптов в штаммах CBS1538 и W34/70 выявило как общие, так и уникальные паттерны экспрессии генов во время ферментации.

Результаты

Профили ферментации штаммов CBS1538 и W34/70

Два S .Для анализа были выбраны штаммы pastorianus , CBS1538 и W34/70, представляющие штаммы группы I и группы II соответственно. Оба штамма демонстрировали сходные профили ферментации при 10% сусле до 4-го дня, но после этого штамм W34/70 ферментировался быстрее, чем штамм CBS1538, и достигал более низкой конечной аттенюации (рис. 1).

Рис. 1. Профили ферментации штаммов группы I CBS1538 и группы II W34/70.

A. Ферментацию проводили в 10% сусле при 13°C в цилиндрических пробирках объемом 15 мл.Потребление сахара измеряли с помощью бриксометра (°Brix). CBS1538: серая линия, W34/70, черная линия. Столбики погрешностей представляют собой стандартные отклонения от среднего значения трехкратной ферментации. Вспомогательные данные доступны в файле вспомогательной информации S1 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.g001

Хромосомный состав штаммов CBS1538 и W34/70

Для сравнения транскриптомов лагерных дрожжей CBS1538 и W34/70 РНК экстрагировали на 2-й и 4-й день мелкомасштабного брожения в 10% сусле.Эти временные точки были выбраны, поскольку предыдущие исследования показали, что это период максимального метаболизма во время ферментации [31]. РНК также экстрагировали из тех же штаммов, выращенных в минимальной среде без аминокислот, чтобы получить исходный уровень для сравнения. Для картирования транскриптов геномы изолятов CBS1538 и W34/70 были секвенированы de novo и сопоставлены с аннотированным и полностью собранным эталонным геномом S . pastorianus 1483 (штамм группы II), а также к комбинированному геному, собранному из родительских эталонных геномов S . cerevisiae и S . эубаянус . Оба подхода дали очень похожие результаты, однако начиная с S . В геноме pastorianus 1483 отсутствовала некоторая информация о S . cerevisiae генов на хромосомах III и VII, для этого анализа использовали данные картирования на объединенные родительские геномы. Информация секвенирования генома и картирования двух штаммов (фиг. 2А и 2В) подтвердила отсутствие S . cerevisiae хромосом II, III, IV, VI, VII, VIII, XII, XIII, XV и XVI в CBS1538 (рис. 2А). Кроме того, мы наблюдали изменения в количестве копий хромосом и различия в гибридных хромосомах по сравнению с ранее зарегистрированным содержанием хромосом обоих штаммов [16, 17, 23] (рис. 2C). Расчетное число копий хромосом составило 48 и 76 для CBS1538 и W34/70 соответственно.

Рис. 2.

Число копий хромосом геномов CBS1538 ( A ) и W34/70 ( B ).Предполагаемое число копий и типы хромосом S . eubayanus (синий) и S . cerevisiae (красный) из de novo секвенирование сопоставлено с объединенными родительскими геномами. Начало каждой хромосомы показано вертикальной пунктирной линией. *, обозначает транслокации между S . eubayanus хромосом II/IV, IV/II, VIII/XV, XV/VIII присутствуют у обоих штаммов. Гибридные хромосомы очевидны по изменению числа копий внутри хромосомы. С . Предполагаемые типы и количество экземпляров S . cerevisiae (красный) и S . eubayanus (синие) и гибридные (красные/синие) хромосомы в CBS1538 и W34/70. Вспомогательные данные для A и B доступны в файлах вспомогательной информации S1 Data и S2 Data соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.g002

Профили экспрессии генов штаммов CBS1538 и W34/70 во время ферментации

Стенограммы были назначены как S . cerevisiae (Sc) или S . eubayanus (Se) на основании идентичности последовательности и распределения хромосом. Всего для штамма W34/70 было обнаружено 11335 транскриптов/открытых рамок считывания (ORF), из которых 5083 были обозначены как S . eubayanus и 6252 как S . cerevisiae (соотношение Se:Sc = 0,81:1) (таблица A в файле S1). Для штамма CBS1538 было обнаружено всего 6798 транскриптов, из них 5163 были S . eubayanus и 1635 были S . cerevisiae (соотношение Se:Sc = 3,16:1). Эти значения хорошо согласуются с ранее определенным числом генов для двух штаммов [38]. Мы исследовали дифференциальную экспрессию генов (DEG) транскриптов, сопоставленных с каждым штаммом, в трех различных экспериментальных условиях (минимальная среда без аминокислот, сусло на 2-й день и сусло на 4-й день) (таблицы B-D в файле S1). У штамма W34/70 наибольшее количество генов, экспрессирующих ДЭГ, было выявлено при сравнении клеток, выращенных на минимальной среде и сусле на 2-й день, где 42% транскриптов дифференциально экспрессировались, а 28% генов дифференциально экспрессировались между ростом в минимальной среде и в сусле на 4-й день.Гораздо более низкий уровень ДЭГ был обнаружен между клетками, выращенными в сусле на 2-й и 4-й дни, где только 14% генов были дифференциально экспрессированы. Характер DEG в CBS1538 был аналогичен наблюдаемому для штамма W34/70 с дифференциальной экспрессией 32% транскриптов между ростом на минимальной среде и сусле на 2-й день, 23% между ростом на минимальной среде и суслом на 4-й день и 16% транскриптов. между ростом сусла на 2-й и 4-й дни.

Как S . pastorianus содержит оба S . cerevisiae и S . субгеномов eubayanus , мы исследовали паттерны DEG для S . cerevisiae или S . аллелей eubayanus в трех разных экспериментальных условиях. В штамме W34/70 S . Гены eubayanus значительно перепредставлены в генофонде с дифференциальной активацией во всех трех сравнениях, но были экспрессированы в ожидаемом соотношении в генофонде с дифференциально подавленной регуляцией (рис. 3А).Интересно, что на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​в сусле в два раза больше аллелей Se активируется по сравнению с аллелями Sc. В штамме CBS1538 аллели Se сверхпредставлены как в генофондах с повышенной, так и с пониженной экспрессией в клетках сусла на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​и в сусле на 2-й день по сравнению с минимальной средой, а также в генофонде с пониженной экспрессией в сусле на 4-й день относительно к минимальному среднему.

Рис. 3. Соотношение и . cerevisiae (Sc) и S . eubayanus (Se) в пулах транскриптов с дифференциальной активацией и подавлением (log 2 -кратное изменение ≥ 1 или ≤ -1) и среднее значение log 2 -кратных изменений в трех условиях по сравнению с CBS1538 и W34 /70.

A. Соотношения дифференциально экспрессируемых генов Se:Sc со значительными отличиями от ожидаемых показаны звездочкой, p≤0,001**, p≤0,05*. B. Диаграммы Венна, показывающие взаимосвязь пулов транскриптов с дифференциальной положительной и отрицательной регуляцией при сравнении трех показанных условий.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.g003

Среднее логарифмическое 2 -кратное изменение для S . cerevisiae и S . Аллели eubayanus в штаммах W34/70 и CBS1538 чрезвычайно согласуются во всех трех сравнениях, что указывает на то, что штаммы CBS1538 и W34/70, а также их субгеномы Se и Sc одинаково реагируют на физиологические условия. Среднее log 2 -кратное изменение и диапазон DEG на 2-й и 4-й дни сусла были меньше, чем наблюдаемые для дифференциальной экспрессии между минимальной средой и суслом на 2-й и 4-й дни для обоих штаммов, за исключением подавления генов в дни. 2 и 4 в CBS1538 (рис. 3А и S1).

Затем мы исследовали взаимосвязь DEG при трех условиях у двух штаммов. Как и следовало ожидать, большое количество генов по-разному экспрессируется при росте на минимальной среде и в сусле на 2-й и 4-й дни как у штаммов CBS1538, так и у штаммов W34/70 (рис. 3В). Хотя число генов меньше, существует перекрытие генов, дифференциально экспрессируемых в сусле на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​и в сусле на 2-й день по сравнению с минимальной средой. С другой стороны, нет дифференциально экспрессируемых генов, специфичных для сусла 2-го дня по сравнению с 4-м днем ​​и для сусла 4-го дня по сравнению с минимальной средой в W34/70, и только 1 ген в этой категории в CBS1538.

Только небольшое количество генов обычно активируется или подавляется во всех трех условиях в штаммах CBS1538 и W34/70 соответственно (рис. 3B и таблица E в файле S1). Обычно активируемый генофонд W34/70 (n = 210) содержит 23 пары ортологичных аллелей Sc и Se, в том числе ADh2 , ADH5 , PGK1 , GPh2 , HX186 198, 8918 NO 198, 8918. , которые играют центральную роль в метаболизме углеводов и ILV6 , необходимых для биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью.Аналогичным образом, аллели Sc и Se LEU4 , LYS1 и SPD1 активируются во всех трех условиях в CBS1538. Пары ортологичных генов также наблюдаются в обычно подавляемом гене обоих штаммов (таблица E в файле S1).

Онтологии генов, обогащенные штаммами CBS1538 и W34/70 в условиях ферментации

Генный онтологический анализ дифференциально экспрессируемых генов в трех условиях в CBS1538 и W34/70 выявил обогащение как углеводного, так и аминокислотного метаболизма на 2-й день ферментации в усиленном генофонде (рис. 4А).Гены, необходимые для утилизации всех основных сахаров, включая сахарозу, фруктозу, галактозу, а также пентозные сахара, наряду с генами, необходимыми для гликолиза и метаболизма пирувата, активируются в сусле на 2-й день по сравнению с минимальной средой, и часть этих генов повышалась на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​и на 4-й день по сравнению с минимальной средой в штамме W34/70. За исключением генов, участвующих в метаболизме крахмала и сахарозы, наблюдаемый обогащенный набор генов для метаболизма углеводов в штамме W34/70 не был обогащен в штамме CBS1538 (рис. 4А).

Рис. 4. Генный онтологический анализ дифференциально экспрессируемых генов в штаммах W34/70 и CBS1538.

Гены, демонстрирующие log 2 -кратное изменение ≥1 (A) или ≤ -1 (B) , были исследованы на наличие обогащенных онтологий генов с использованием Cluego. На тепловой карте показаны отклонения от ожидаемого соотношения аллелей Sc и Se; ожидаемое соотношение бежевый, >ожидаемое соотношение; градиент от бежевого к красному, соотношение < ожидаемое; градиент от бежевого до синего. Пустые ячейки, без обогащения. Ожидаемое отношение CBS1538 Sc:Se = 0.24:0,76, Ж34/70, Sc:Se = 0,55:0,45.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.g004

Гены биосинтеза и метаболизма аминокислот обогащаются во время ферментации в сусле у штаммов CBS1538 и W34/70 (рис. 4А). В дополнение к обогащению генов этих основных метаболических активностей у двух штаммов, мы наблюдали различия в онтологиях специфических генов между двумя штаммами, причем гены, участвующие в метаболизме глицеролипидов, метаболизме порфирина, переносчиках ABC, активности пероксисом и долголетии, повышены в W34. /70, но не штамм CBS1538.

Гены, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот, репарации ДНК и репликации ДНК, подавляются в условиях ферментации и на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​в сусле в штамме W34/70, при этом подмножество этих генов аналогично регулируется в штамме CBS1538 (рис. 4B). . Точно так же гены, участвующие в основных анаболических путях, таких как синтез белка, включая гены, необходимые для биогенеза рибосом и процессинга рРНК, мРНК и тРНК, подавляются в сусле и на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​у обоих штаммов.Интересно, что набор генов, участвующих в метаболизме жирных кислот, глицерофосфолипидов и стероидов, необходимых для производства мембранных компонентов, однозначно подавляется в штамме CBS1538 (рис. 4В).

Мы изучили вклад субгеномов Sc и Se в эти обогащенные пути. Было замечено, что аллели Se и Sc вносят вклад в ожидаемое соотношение Se:Sc или в более высокой пропорции, чем ожидалось, в дифференциально регулируемый генофонд (рис. 4A и 4B). Аллели Se вносят больший вклад, чем ожидалось, на 2-й и 4-й дни ферментации в некоторые онтологии генов в штамме W34/70 (рис. 4А, прямоугольники, заштрихованные фиолетово-синим градиентом).И наоборот, мы наблюдали, что аллели Sc в большей степени, чем ожидалось, вносят вклад в метаболизм аминокислот в штамме CBS1538 при всех трех условиях (рис. 4A, прямоугольники, заштрихованные красным градиентом). Для некоторых конкретных путей мы наблюдали, что аллели Se отвечают за все дифференциально регулируемые гены, например, аллели Se используются исключительно в метаболизме гистидина на 2-й день по сравнению с 4-м днем ​​в штамме W34/70 и в ассоциированных с фагосомами генах в сусле в день. 2 относительно 4-го дня и метаболизма сфинголипидов, бутанатов и тиамина на 4-й день относительно минимальной среды в CBS1538 (фиг. 4A, темно-синие прямоугольники).

Для подавленных генов мы наблюдаем, что аллели Sc вносят вклад в онтологии генов в ожидаемом соотношении, а в некоторых путях — в большей пропорции, чем ожидалось, по отношению к соотношению Sc:Se для всего генома в обоих штаммах, в то время как аллели Se вносят исключительный вклад на три категории, а именно один пул углерода за счет биосинтеза фолиевой кислоты, жирных кислот и стероидов в штамме CBS1538 (рис. 4B, темно-синие прямоугольники).

Влияние дозы генов на профили экспрессии генов

Как S .Штаммы pastorianus являются анеуплоидными по своей природе и имеют различные номера копий S . cerevisiae и S . eubayanus хромосом, нам было интересно определить, влияет ли количество копий аллелей Sc и Se на профили экспрессии генов. Число копий для каждого гена Sc и Se рассчитывали на основе охвата последовательностей секвенирования генома de novo . DEG ортологов Sc и Se в каждом штамме определяли для трех экспериментальных условий и коррелировали с соотношением числа копий гена Sc:Se.Данные для ортологов Sc и Se, экспрессированных на 2-й день, показаны на рис. 5. Данные для 4-го дня и минимальной среды показаны на рис. S2. Ортологи Sc и Se присутствуют в различных соотношениях в штамме W34/70 (рис. 5А). . Анализ некоторых 1555 ортологов Sc и Se показывает, что DEG аллелей Sc и Se положительно коррелирует с отношением числа копий аллелей Sc:Se (рис. 5B, p<0,0001, R 2 = 0,90). По мере увеличения числа копий гена Sc также увеличивается уровень транскриптов Sc и, наоборот, для аллелей Se.При соотношении Sc:Se 1:2 и 3:4 преобладают транскрипты Se, тогда как при соотношениях 3:1, 4:1 и 5:1 преобладают аллели Sc (рис. 5А). Интересно, что при соотношении 1:1 в штамме W34/70 преобладают аллели Se, а при соотношении 3:2, 2:1 уровни обоих транскриптов практически равны. Взаимосвязь между DEG ортологов Sc и Se и соотношением числа копий генов наблюдается для генов как на родительских, так и на гибридных хромосомах, как показано на рис. 5C для хромосомы X. Штамм W34/70 имеет четыре копии хромосомы X, две Sc , одна Se и одна гибридная хромосома (Sc/Se) с точкой рекомбинации, расположенной в гене THD2 (YJR009C) (рис. 2C).Соотношение Sc:Se слева от TDh3 составляет 3:1, а справа 1:1 (рис. 2В). Для генов слева от TDh3 преобладает экспрессия аллелей Sc из-за большего количества копий Sc, тогда как справа преобладают аллели Se, несмотря на одинаковое количество копий (рис. 5C). Корреляция паттернов DEG с отношением числа копий гена-ортолога наблюдалась во всех трех экспериментальных условиях (S2 Fig).

Рис. 5. Влияние количества копий гена на паттерны экспрессии генов.

DEG ортологов Sc к Se были сгруппированы в соответствии с отношением Sc к Se числа копий гена в W34/70 ( A ) и CBS1538 ( D ).Показаны данные для 2-го дня в сусле. Данные для дня 4 и минимальной среды показаны на рисунке S2. Количество парных ортологов при каждом соотношении количества копий для генов, показывающих log 2 ≤-1 и log 2 ≥1, показано над графиками. Б . Корреляция дифференциальной экспрессии ортологов генов Sc и Se в W34/70 с соотношением числа копий ортологов гена. Среднее значение log 2 -кратных изменений экспрессии между ортологами Sc и Se нанесено на график в зависимости от отношения количества копий гена Sc:Se ортолога.Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. C. Log 2 -кратная разница в экспрессии генов между ортологами Sc и Se на хромосоме X в W34/70. Пунктирной линией отмечен сайт рекомбинации ( THD2 ) на гибридной хромосоме. Соотношение Sc:Se слева от вертикальной пунктирной линии составляет 3:1, а после 1:1.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.g005

Анализ экспрессии генов ортологов Sc и Se в штамме CBS1538 представил другой сценарий.Во-первых, из-за уменьшения содержания генома Sc у штамма CBS1538 общее число ортологов значительно меньше (n = 237). Во-вторых, вариации числа копий намного меньше, причем большинство ортологов с log 2 -кратным изменением ≥ 1 или ≤ 1 присутствуют в соотношении Sc:Se, 1:2 (рис. 5D). Есть только два аллеля в соотношении 2:3 и один в соотношении 2:1 (рис. 5D). Удивительно, но мы видим другой паттерн экспрессии, отличный от наблюдаемого в W34/70; при соотношении Sc:Se 1:2 большинство аллелей Sc демонстрируют более высокие уровни транскриптов, чем ортологичные аллели Se, хотя для некоторых ортологов очевидна обратная картина экспрессии.

Сравнение транскриптомов штаммов CBS1538 и W34/70

Чтобы напрямую сравнить стабильные ландшафты мРНК в штаммах CBS1538 и W34/70, мы создали сводный транскриптом для каждого штамма, получив сумму транскриптов аллелей Sc и Se, закодированных для каждого гена (таблица F в файле S1). Мы сравнили экспрессию этого набора генов у двух штаммов в трех разных экспериментальных условиях (рис. 6 и таблица G в файле S1). Существует высокая степень перекрытия между дифференциально выраженным генофондом обоих штаммов, что позволяет предположить, что оба штамма одинаково реагируют на условия окружающей среды (рис. 6А).Рост в минимальной среде вызывал наибольшую специфичность DEG между двумя штаммами, но значительное количество генов также специфически экспрессировалось в сусле на 2-й и 4-й день соответственно. Мы идентифицировали 319 генов, специфичных для CBS1538, которые активируются во всех трех условиях, а также 299 генов, специфичных для W34/70. Список специфических для состояния и штамма генов показан в таблице H в файле S1. Анализ онтологий генов, связанных с дифференциально экспрессируемым набором генов, выявил различия между штаммами CBS1538 и W34/70 (рис. 6В).Во-первых, мы наблюдали, что гены, связанные с биосинтезом рибосом, активируются на 2-й и 4-й день в сусле у штамма W34/70, в то время как гены, связанные с метаболизмом определенных аминокислот, пентозофосфатным путем и окислительным фосфорилированием, также активируются на 2-й день в этом штамме. . Гены, связанные с репарацией ДНК, процессингом и транспортом белков, активируются в минимальной среде в W34/70. И наоборот, гены, связанные с биосинтезом мембран, метаболизмом сахаров и метаболизмом аминокислот, активируются в минимальной среде в CBS1538, и часть этих генов также активируется на 4-й день в сусле.Удивительно, но нет онтологий генов, обогащенных на 2-й день в штамме CBS1538 (рис. 6B).

Рис. 6. Сравнение экспрессии генов у штаммов CBS1538 и W34/70.

Прочтения транскриптов для аллелей Sc и Se были суммированы в CBS1538 и W34/70 соответственно для создания комбинированного транскриптома. Профили экспрессии генов в трех условиях, рост в минимальной среде, в сусле на 2-й день и в сусле на 4-й день сравнивали между двумя штаммами. A. Диаграмма Венна генов с повышенной экспрессией в штаммах CBS1538 и W34/70. B. Онтологии генов (ГО), обогащенные штаммами CBS1538 и W34/70 соответственно. Левая панель, ГО с повышенной экспрессией в CBS1538, правая панель, ГО с повышенной экспрессией в W34/70. Параметры для выбора терминов GO были следующими: p-значение менее 0,05, минимальное количество четырех генов на путь, пути, содержащие более 25% дифференциально регулируемых генов. Тепловая карта показывает процент генов, связанных с каждым термином GO: градиент от синего к красному, где синий представляет минимум 25% связанных генов, а красный представляет максимум 60% связанных генов. C. Взаимосвязь числа копий гена и экспрессии гена в W34/70 и CBS1538. Отношение числа копий гена к сумме всех аллелей (Sc+Se) сравнивали с Log 2 -кратными различиями в экспрессии генов у W34/70 и CBS1538. Количество генов в каждой категории соотношения показано над столбиками. Показаны данные для 2-го дня в сусле. Данные для дня 4 и минимальной среды показаны на рис.

S3.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.g006

Поскольку число копий гена для суммы транскриптов генов-ортологов все еще варьировало между двумя штаммами и было показано, что оно влияет на профили экспрессии генов внутри штамма, мы смотрели, чтобы увидеть, влияет ли количество копий гена на DEG, наблюдаемый между CBS1538 и W34/70.Для этого мы сравнили log 2 кратных изменений экспрессии генов между двумя штаммами с отношением общего числа копий гена (сумма всех аллелей Se и Sc) для каждого гена. Данные по экспрессии генов на 2-й день в сусле показаны на рис. 6С. Существует значительная положительная корреляция между кратным изменением log 2 и отношением общего числа копий гена между двумя штаммами (p<0,001, R 2 = 0,8). Эта корреляция наблюдалась во всех трех экспериментальных условиях (S3 Fig).Таким образом, как наблюдается для экспрессии генов внутри штамма, дозировка генов играет значительную роль в DEG между штаммами CBS1538 и W34/70.

Обсуждение

Происхождение и эволюция лагерных дрожжей широко обсуждаются, и было предложено несколько гипотез, объясняющих различия в составе хромосом и количестве копий между штаммами [20,22,23]. Основное различие между штаммами группы I и II заключается в потере значительной части S . cerevisiae субгенома за счет потери целых хромосом в штаммах группы I.Кроме того, между штаммами внутри каждой группы существуют различия в составе хромосом, количестве копий, а также количестве и типе гибридных хромосом. Несмотря на эти различия, штаммы из обеих групп сбраживают сахара и производят ароматное пиво, при этом отдельные штаммы демонстрируют вариации в окончательном профиле ароматических летучих веществ [24]. Основное различие между штаммами группы I и II заключается в способности ферментировать мальтотриозу. В то время как все штаммы группы II могут поглощать и ферментировать мальтотриозу, только часть штаммов группы I имеет необходимые транспортеры для импорта этого трисахарида [39-41].Здесь мы исследовали профили экспрессии генов во время ферментации в сусле и при росте в минимальной среде репрезентативных штаммов групп I и II. Штамм группы I, использованный в этом исследовании, CBS1538, не ферментирует мальтотриозу. Здесь мы подтверждаем превосходную скорость ферментации штамма W34/70 группы II: два штамма потребляют сахара с одинаковой скоростью до 4-го дня, после чего штамм W34/70 ферментировался с более высокой скоростью.

Нам было интересно понять, как два субгенома, присутствующие в двух штаммах лагерных дрожжей, вносят вклад в общий транскриптом во время ферментации и, кроме того, каковы последствия сокращения S . cerevisiae субгенома к паттернам экспрессии генов между CBS1538 и W34/70. Сложные геномы лагерных дрожжей создают несколько проблем для анализа транскриптомов этих штаммов. В настоящее время только один S . pastorianus Геном группы II, геном штамма CBS1483, был полностью аннотирован и собран в хромосомы, и он служит эталонным геномом для S . pastorianus в NCBI [20], хотя также доступно до 16 аннотированных геномов https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/eukaryotes/342/. Из-за различий в количестве копий хромосом и хромосомных перестроек эталонный геном может быть не идеальным геномом для картирования транскриптов, например, он отличается от двух штаммов, использованных в этом исследовании, отсутствием гибридных хромосом III и VII. Существуют также различия в количестве копий хромосом между штаммами, используемыми здесь, и эталонным штаммом.

Чтобы избежать таких проблем, мы повторно секвенировали штаммы W34/70 и CBS1538, которые были сопоставлены с геномом, созданным de novo , состоящим из объединенных эталонных геномов родительских штаммов S . cerevisiae и S . эубаянус . Количество копий для каждой хромосомы и генов в ней определяли по глубине охвата последовательностей из секвенирования de novo . Транскрипты РНК также были картированы в этом комбинированном геноме.

Мы отметили некоторые отличия в составе хромосом W34/70 и CBS1538 от опубликованных данных [16,23,42]. В частности, мы отметили одну дополнительную копию хромосом Sc III, VII, XIV и XVI по отношению к последней опубликованной последовательности генома W34/70 [23].Кроме того, мы подтверждаем наличие гибридной хромосомы ScVIII/SeVIII, рекомбинирующей в YHR165C , которая была ранее идентифицирована в штамме W34/70 и в другом штамме группы II, 7012, нашей группой [12,21], но которая не задокументировано в других опубликованных последовательностях [16,23]. Для CBS1538 мы отметили только две разницы в количестве копий, дополнительную копию как Se VI, так и SeVIII. Различия в числе копий хромосом также отмечены между опубликованными геномами для W34/70 [16,23,42]. Различия в количестве копий между исследованиями могут возникать из-за различий в методах, используемых для определения глубины охвата последовательностей, или могут отражать подлинные различия между изолятами штаммов.Штаммы лагерных дрожжей появились всего около 500–600 лет назад и, таким образом, могут все еще испытывать геномный поток на этой ранней стадии эволюции. Ранее мы показали, что геномы лагерных дрожжей являются динамичными и могут подвергаться хромосомным перестройкам с образованием новых гибридных хромосом, а также изменению числа копий хромосом после воздействия стресса, такого как высокие температуры [43]. Кроме того, ферментации, проводимые в сусле с высоким удельным весом (22°P) при температуре окружающей среды 20°C, что выше, чем при обычном брожении (13°C), приводили к изменению числа копий хромосом в одном цикле ферментации. ферментация [43].Таким образом, различия в размножении и культивировании S . pastorianus могут способствовать различиям, наблюдаемым между изолятами штаммов.

Анализ паттернов экспрессии генов показывает, что штаммы CBS1538 и W34/70 одинаково реагируют на физиологические условия, предъявляемые обоими штаммами, демонстрируя аналогичные средние log 2 -кратные изменения во всех сравниваемых условиях. Интересно, что мы наблюдали, что субгеномы Sc и Se по-разному используются в различных физиологических условиях, при этом аллели Se вносят значительный вклад в экспрессию генов на 2-й день ферментации у обоих штаммов и на 4-й день у штамма W34/70.

Генный онтологический анализ выявил повышенную регуляцию путей, связанных с метаболизмом углеводов и аминокислот, на 2-й день ферментации, хотя в штамме CBS1538 наблюдалось меньшее обогащение генов, связанных с метаболизмом сахаров. Повышение метаболизма углеводов и аминокислот на ранних стадиях брожения согласуется с тем, что известно об общей метаболической активности дрожжей во время брожения. Клетки претерпевают 1-2 удвоения в течение первых трех дней брожения, а затем количество клеток остается неизменным или несколько уменьшается.Отсутствие представления генов, связанных с углеводным обменом в штамме CBS1538, за исключением генов, связанных с метаболизмом крахмала и сахарозы, отличает эти два штамма и, по-видимому, отражает различия в метаболической активности. Поскольку общее потребление сахара у двух штаммов на 2-й день одинаково, возможно, гены, связанные с метаболизмом углеводов, у штаммов CBS1538 индуцируются, но не достигают порогового значения для анализа. Похоже, что метаболизм сахара у этого штамма не замедляется, поскольку в противном случае мы могли бы ожидать увидеть активацию таких генов на 4-й день.Наблюдаемые различия в метаболизме углеводов могут отражать отмеченные ранее различия в типах и числе копий генов, кодирующих переносчики мальтозы и мальтотриозы, между двумя штаммами [39–41].

Активация генов, связанных с метаболизмом аминокислот, имеет важное значение, поскольку вторичные метаболиты, связанные с ароматом, такие как высшие спирты и сложные эфиры, образуются в результате катаболизма аминокислот. Онтология генов также выявила различия в метаболизме между двумя штаммами.Например, гены, связанные с метаболизмом метана и серы, которые также могут влиять на вкусовые характеристики, активируются в W34/70, но не в CBS1538.

Генный онтологический анализ подтверждает чрезмерное представительство аллелей Se в активированных генах в штамме W34/70 и дополнительно идентифицирует специфические пути, в которых исключительно обогащены аллели Sc или Se. Учитывая пониженное содержание Sc в штамме CBS1538, удивительно, что аллели Sc, по-видимому, чрезмерно представлены в генах, обогащенных несколькими путями.В частности, мы видим, что аллели Sc способствуют биосинтезу аргинина и лизина и метаболизму тирозина на более высоком уровне, чем ожидалось, исходя из соотношения Sc:Se для всего генома. Мы также заметили, что аллели Sc с большей вероятностью будут подавляться, чем аллели Se в штаммах CBS1538 и W34/70, однако специфические пути здесь также содержат исключительно аллели Se.

Предыдущие исследования на гаплоидном S . cerevisiae показали, что устойчивые уровни транскриптов мРНК строго контролируются для поддержания гомеостаза.Нарушение оборота мРНК, например, делецией основной 5′-3′-экзонуклеазы XRN1 , компенсируется изменениями транскрипции РНК-полимеразы II для восстановления гомеостаза [44,45]. Наоборот, увеличение скорости транскрипции в результате увеличения числа копий гена приводит к компенсаторным изменениям в обороте мРНК для сохранения ожидаемых уровней мРНК в стационарном состоянии [46]. Однако недавний анализ лабораторных и диких S . cerevisiae не выявили доказательств дозовой компенсации, а вместо этого описали прямую корреляцию между числом копий гена и уровнями экспрессии гена [47].

Здесь мы показываем, что анеуплоидная природа S . геномов pastorianus напрямую влияет на характер экспрессии генов во время ферментации. Мы наблюдали положительную корреляцию между числом копий ортолога и устойчивыми уровнями транскриптов ортолога в штамме W34/70: по мере увеличения числа копий генов Sc или Se также увеличиваются связанные уровни транскриптов. Интересно, что когда соотношение числа копий гена-ортолога составляет 1:1, мы наблюдали, что аллели Se демонстрировали более высокие уровни транскриптов, чем аллели Sc, во всех протестированных условиях.Удивительно, но схема использования ортологов отличается в штамме CBS1538. Хотя соотношение генов Sc:Se менее вариабельно, при этом большинство ортологов представлены в соотношении 1:2, здесь мы наблюдали, что ортологи Sc производят относительно более высокие уровни транскриптов, чем аналог Se, хотя существует большая вариация в распределении генов. паттерны экспрессии генов среди ортологов при этом соотношении в штамме CBS1538. При том же соотношении у штамма W34/70 преобладают аллели Se.Чрезмерное представление S . Аллели cerevisiae в некоторых биохимических процессах, таких как метаболизм аминокислот, могут объяснить избирательное сохранение S . cerevisiae хромосом в штамме CBS1538, поскольку, возможно, имело место селективное эволюционное давление, направленное на сохранение специфических генов, необходимых во время ферментации.

S . eubayanus родоначальник лагерных дрожжей является криотолерантным штаммом, и поэтому можно предположить, что аллели Se будут предпочтительнее во время ферментации, проводимой при 13°C.Мы действительно наблюдали больший вклад аллелей Se в транскриптом штамма W34/70 в условиях ферментации, однако он не является универсальным, и этот вклад сдерживается эффектами числа копий гена. Анализ транскриптома штамма группы I, CBS1513, также выявил сверхпредставленность S . eubayanus при выращивании культур при низких температурах [37].

Чтобы сравнить общие стабильные уровни транскриптов, кодирующих белок, в штаммах CBS1538 и W34/70, мы создали комбинированные транскриптомы для каждого штамма путем суммирования транскриптов Sc и Se, которые кодируют один и тот же белок.Используя этот подход, мы заметили, что общие паттерны транскрипции были сходными между двумя штаммами, что указывает на то, что, несмотря на значительные различия на уровне генома и путях эволюции, две группы лагерных дрожжей демонстрируют сходные паттерны транскрипции в условиях ферментации. Тем не менее, анализ онтологии генов выявил некоторые уникальные паттерны транскрипции. В соответствии с тем, что наблюдалось для дифференциальной экспрессии аллелей Sc и Se внутри штамма, характер экспрессии генов в обоих штаммах значительно зависел от числа копий гена.Таким образом, можно ожидать, что профили экспрессии генов могут отличаться у других S . pastorianus из-за различий в количестве копий хромосом между штаммами.

Наш анализ экспрессии генов-ортологов внутри штамма и между штаммами показывает, что анеуплоидные геномы лагерных дрожжей создают сложные паттерны экспрессии генов во время ферментации и что количество копий гена играет решающую роль в паттернах экспрессии генов как внутри штамма и между штаммами.

Материалы и методы

Штаммы дрожжей и условия роста

Штамм группы I, CBS 1538, был получен из Collection de Levures d’Interet Biotechnologique, Париж, Франция, а штамм группы II Weihenstephan 34/70 (W34/70) был любезно предоставлен доктором Юргеном Вендландом, Geisenheim Hoch Universitat. , Германия. Для размножения штаммы выращивали в среде YPDM (1% (масса/объем) дрожжевого экстракта, 2% (масса/объем) пептона и 1–2% (масса/объем) как декстрозы, так и мальтозы при 20–25°C; 2% YPDM содержит 1% декстрозы и 1% мальтозы.

Небольшие ферментации (10 мл) проводили в 10% сусле, содержащем 1 мМ ZnSO 4 (Spraymalt, Brewferm, Amber 18EBC, Brouland, Бельгия) в стеклянных пробирках объемом 15 мл.

Клетки

сначала размножали в 200 мл 4% YPDM при 25°C в течение двух дней и вносили в сусло с плотностью клеток 1,5×10 7 /мл. Для ферментации в небольшом масштабе аликвоты по 10 мл исходной ферментационной культуры добавляли в стеклянные пробирки на 15 мл, каждая из которых была снабжена гидрозатвором, прикрепленным к пробке.Отдельные пробирки использовались для отбора проб через определенные промежутки времени. Все ферментации проводили при 13°C без встряхивания. После отбора проб измеряли удельный вес сусла с помощью рефрактометра ( HANNA , Румыния). Остаточные культуры после мелкомасштабной ферментации центрифугировали, а клетки сохраняли для выделения РНК.

Клетки

также выращивали в течение ночи в 2% YPDM, промывали стерильной водой и инокулировали при плотности клеток 1×10 6 клеток/мл в 60 мл минимальной среды (0.17% азотная основа дрожжей без аминокислот и солей аммония с добавлением 1% декстрозы и 1% мальтозы и 0,5% (Nh5) 2 SO 4 в качестве источника азота. Культуры выращивали при 20°С в трех экземплярах и клетки собирали в экспоненциальной фазе.

Экстракция ДНК,

de novo секвенирование генома и анализ вариаций числа копий Экстракцию ДНК

проводили по протоколу, описанному [48]. Вкратце, дрожжевые клетки выращивали в течение ночи в культуре 5 мл 2% YPDM.Клетки осаждали, промывали дистиллированной водой и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в 500 мкл 0,9 М сорбита и 0,1 М ЭДТА, рН 7,5, добавляли 30 мкл раствора литазы (1,5 мг/мл) и инкубировали 20–40 мин. После этого сферопласты извлекали центрифугированием и ресуспендировали в 500 мкл 50 мМ трис-HCl и 20 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 13 мкл 10% SDS. Образцы инкубировали при 65°С в течение 5–10 мин. Добавляли 200 мкл 5М ацетата калия и пробирки инкубировали на льду в течение 10 мин.После центрифугирования в супернатант добавляли 700 мкл 100%-ного изопропанола, образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем центрифугировали. Осажденную ДНК дважды промывали 70%-ным этанолом, сушили на воздухе при комнатной температуре и ресуспендировали в 50 мкл воды.

Тотальную ДНК

обрабатывали РНКазой А (10 мкг/мл) в течение 30 мин при 37°С. ДНК осаждали и ресуспендировали в 50 мкл воды. Качество ДНК определяли электрофорезом в агарозном геле и определением соотношения ОП 260 :ОП 280 с использованием спектрофотометра Nanodrop (Epoch 2, Agilent BioTek).Секвенирование генома De novo было проведено компанией Novogene (www.novogene.com) с использованием технологии Illumina на ридах с парными концами (150 п.н.). Последовательности генома были депонированы в базу данных SRA в Национальном центре биотехнологической информации https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA810967.

После обрезки ридов с парными концами с помощью trim_galore (версия 0.6.6, вызывающая cutadapt версии 2.10) риды были картированы с помощью Bowtie2 (версия 2.4.2) [49,50] в родительские геномы S . pastorianus CBS1483, (сборка ASM1102231v1) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Saccharomyces+pastorianus, или к комбинированному геному S . cerevisiae и S . eubayanus производный от S . cerevisiae S288C, сборка R64 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Saccharomyces+cerevisiae и S . eubayanus (SEU3.0) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Saccharomyces+eubayanus.

В дополнение к предварительным настройкам «—fast-local» были установлены параметры, ограничивающие размер вставки длиной от 200 до 1000 пар оснований. Сопоставленные чтения были отфильтрованы через samtools (версия 1.11), чтобы исключить чтения, которые не были сопоставлены парами и не являлись первичным выравниванием (-F 268), и включить только чтения с высоким качеством сопоставления (-q 44).

Для гибридных хромосом гены были обозначены как S . cerevisiae или S . eubayanus на основе их местоположения, связанного с известными сайтами рекомбинации, и их % идентичности родительским геномам.Чтение из секвенирования ДНК de novo , сопоставленного с комбинированными геномами эталонных штаммов S . cerevisiae и S . eubayanus были преобразованы в отсортированные файлы BAM с помощью samtools, и данные были извлечены как количество прочтений/500 п.н., а затем нормализованы по размеру библиотеки (общее количество прочтений), чтобы получить предполагаемое число копий хромосом [51].

Экстракция РНК и секвенирование

Экстракцию РНК

проводили по протоколу, описанному ранее [52], но с некоторыми модификациями.Клетки ресуспендировали в 400 мкл буфера, содержащего 50 мМ NaOAc, pH 5,2, 10 мМ EDTA, pH 8,0 и 40 мкл 10% SDS, 400 мкл фенол-хлороформ-изоамилового спирта (PCA; 25:24:10), pH 4.2, и добавляли 100 мкл промытых кислотой стеклянных шариков. Пробирки помещали в термоблок при 65°С на 10 мин и периодически встряхивали. Образцы помещали на лед на 5 мин. После центрифугирования супернатант повторно экстрагировали ПХА, рН 4,2, а затем один раз хлороформом. Нуклеиновые кислоты в супернатанте осаждали, дважды промывали 70% этанолом и затем ресуспендировали в 100 мкл не содержащей РНКазы H 2 O.Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра Nanodrop, а целостность РНК проверяли с помощью биоанализатора Agilent 2100 в соответствии с инструкциями производителя.

Секвенирование РНК

было проведено на библиотеках кДНК с использованием платформы HiSeq4000 Illumina в центральном центре Genomic Technologies в Манчестерском университете. Библиотеки были созданы с использованием анализа мРНК TruSeq Stranded (Illumina, Inc.) в соответствии с протоколом производителя. Набор данных RNAseq был депонирован в базу данных GEO на сайте NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE197654.

В качестве эталонного генома для картирования объединены S . cerevis iae и S . Были использованы геномы eubayanus , но с вариациями, присутствующими в повторно секвенированных штаммах CBS1538 и W34/70. Для этого консенсусные последовательности Fasta были сгенерированы из данных WGS, сопоставленных с S . cerevis iae и S . eubayanus с помощью внутреннего Perl-скрипта. Чтобы перенести аннотацию генов из этих геномов, вставки и делеции игнорировались, а учитывались только замены нуклеотидов.Парные данные RNA-Seq были сопоставлены с этими штаммо-специфичными эталонными геномами с использованием STAR [53]. Чтение с множественным сопоставлением обрабатывается с помощью параметра outSAMmultNmax, установленного в 1, и параметра outMultimapperOrder, установленного в «случайный». Кроме того, благодаря фильтрации с помощью samtools (-q 255) сохранялись только выравнивания самого высокого качества. Для агрегирования количества прочтений был использован инструмент «featureCounts» для сопоставленных данных вместе с аннотацией гена из S . cerevis iae и S . eubayanus геном [54]. С установленными параметрами -B и -P учитывались только подсчеты прочтений, оба конца которых выровнены на расстоянии 50–600 пар оснований.

числа прочтений картирования РНК были загружены в iDEP9.1 [55]. Данные были преобразованы для кластеризации и PCA с помощью EdgeR с использованием минимального CPM 0,5 в 1 библиотеке и добавления псевдосчета 4. Анализ PCA использовался для проверки воспроизводимости повторов. Выпадающие повторы были удалены, а данные повторно обработаны. Дифференциально экспрессированные гены (DEG) рассчитывали с использованием DESeq2 с порогом ложного обнаружения (FDR), равным 0.05 и минимальное логарифмическое 2 кратное изменение ≥1 или ≤-1. Диаграммы Венна были построены с использованием онлайн-инструмента (http://bioinformatics.psb.ugent.be/). Количество копий для каждого гена было извлечено из охвата прочтений секвенирования генома de novo S . пасторианус штаммов.

Обогащение ДЭГ проводили с помощью ClueGO [56]. Параметры, используемые на ClueGo, были установлены следующим образом: Saccharomyces cerevisiae S228C использовались в качестве списка создателей нагрузки.Для анализа использовалась онтология KEGG со следующими фильтрами: значение p менее 0,05, минимальное количество четырех генов на путь, пути, содержащие более 25% регулируемых генов, показатель Каппа был установлен на уровне 0,4. Был применен двусторонний гипергеометрический критерий и pV-коррекция Бенджамини-Хохберга. С . eubayanus -подобные названия аллелей были переведены в S . cerevisiae названий генов для анализа ClueGo.

Комбинированный транскриптом S . генов pastorianus были сгенерированы путем суммирования прочтений для S . cerevisiae и S . eubayanus ортологов с использованием функции консолидации в Excel. Несовпадающие гены были сохранены в комбинированном транскриптоме с считываниями, картированными соответственно S . cerevisiae или S . eubayanus эталонных геномов. Объединенный геном содержал 7568 уникальных идентификаторов генов. Количество копий для каждого гена было извлечено из охвата прочтений секвенирования генома de novo S . pastorianus штаммов и суммировали для совпадающих ортологов, чтобы получить общее количество копий гена для каждого гена id.

Статистика

Частота ложных открытий для DEG и генных онтологий определялась с использованием поправки Бенджамини-Хохберга. Тесты хи-квадрат использовались для определения обогащения генов из субгеномов в различных используемых физиологических условиях.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Диаграмма в виде прямоугольников и усов дифференциальной экспрессии генов Se и Sc в сравнении между днем ​​2 и минимумом, днем ​​4 и минимумом и днем ​​2 и днем ​​4.

Поле простирается от 25-го до 75-го процентиля, среднее значение показано полосой внутри прямоугольника. Усы показывают минимальное и максимальное значения в наборе данных.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.s001

(TIF)

S2 Рис. Влияние количества копий гена на характер экспрессии генов на 4-й день и в минимальной среде.

DEG ортологов Sc к Se были сгруппированы в соответствии с отношением Sc к Se количества копий гена в W34/70 ( A ) и CBS1538 ( D ).Данные минимальной среды для дня 4 (D4) и показаны. Количество парных ортологов при каждом соотношении числа копий показано над графиками. Б . Корреляция дифференциальной экспрессии ортологов гена Sc:Se в W34/70 с соотношением числа копий гена-ортолога. Среднее значение log 2 -кратных изменений экспрессии между ортологами Sc и Se нанесено на график в зависимости от отношения количества копий гена Sc:Se ортолога. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. C. Log 2 -кратная разница в экспрессии генов между ортологами Sc и Se на хромосоме X в W34/70.Пунктирной линией отмечен сайт рекомбинации ( THD2 ) на гибридной хромосоме. Соотношение Sc:Se слева от вертикальной пунктирной линии составляет 3:1, а после 1:1.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.s002

(TIF)

S3 Рис. Взаимосвязь числа копий гена и экспрессии гена в W34/70 и CBS1538.

Отношение количества копий гена к сумме всех аллелей (Sc+Se) сравнивали с Log 2 -кратными различиями в экспрессии генов у W34/70 и CBS1538.Количество генов в каждой категории соотношения показано над столбиками. Показаны данные для 4-го дня в сусле и для роста на минимальной среде. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего Log 2 -кратного изменения экспрессии генов между штаммами WS34/70 и CBS1538.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.s003

(TIF)

Файл S1. Дополнительные таблицы.

Таблица A в файле S1 . Таблица необработанных показаний для трех образцов роста в минимальной среде (мин) в сусле на 2-й день (2-й день) и в сусле на 4-й день (4-й день).Geneid соответствует S . eubayanus или S . cerevisiae генидов из эталонных геномов. Там, где имена генов известны, они были добавлены в столбец 2. Столбцы 3 и 4 показывают количество копий для каждого гена в CBS1538 и W34/70 соответственно. Таблица B в файле S1 . Дифференциальная экспрессия генов для сравнения считываний транскриптов в сусле на 2-й день с ростом в минимальной среде. Показаны логарифмическое изменение в 2 раза и значения с поправкой на p для каждого гена. Таблица C в файле S1 . Дифференциальная экспрессия генов для сравнения считываний транскриптов в сусле на 4-й день с ростом в минимальной среде. Показаны логарифмическое изменение в 2 раза и значения с поправкой на p для каждого гена. Таблица D в файле S1 . Дифференциальная экспрессия генов для сравнения считываний транскриптов в сусле на 2-й и 4-й день. Показаны логарифмическое 2-кратное изменение и значения с поправкой на p для каждого гена. Таблица E в файле S1 . Список генов с повышенной и пониженной регуляцией при сравнении всех трех условий: день 2 с минимальным, день 4 с минимальным и день 2 с днем ​​4. Таблица F в файле S1 . Сводный транскриптом CBS1538 и W34/70. Комбинированный транскриптом S . генов pastorianus были сгенерированы путем суммирования прочтений для S . cerevisiae и S . eubayanus ортологов с использованием функции консолидации в Excel. Несовпадающие гены были сохранены в комбинированном транскриптоме с считываниями, картированными соответственно S . cerevisiae или S . eubayanus эталонных геномов.Показаны необработанные показания для трех образцов роста в минимальной среде (мин) в сусле на 2-й день (2-й день) и в сусле на 4-й день (4-й день). Количество копий для каждого гена было извлечено из охвата прочтений секвенирования генома de novo S . pastorianus штаммов CBS1538 и W34/70 соответственно и картирован в комбинированном геноме S . cerevisiae и S . eubayanus производный от S . cerevisiae S288C, сборка R64 и S . eubayanus (SEU3.0) и суммировали для соответствующих ортологов, чтобы получить общее количество копий гена для каждого идентификатора гена (столбцы D и E). Гены с нулевыми прочтениями были удалены из набора данных. Таблица G в файле S1 . Данные дифференциальной экспрессии генов из сводного анализа транскриптома. Дифференциальная экспрессия генов для сравнения считываний транскриптов в CBS1538 и W34/70 в минимальной среде и в сусле на 2-й и 4-й день. Показаны логарифмическое 2-кратное изменение и значения с поправкой на p для каждого гена. Таблица H в файле S1 . Список генов с повышенной и пониженной регуляцией в CBS1538 и W34/70 из сводного набора данных транскриптома при трех физиологических условиях, изученных в этом исследовании, и их пересечения.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.s004

(XLSX)

Данные S2. Чтение из

de novo секвенирования ДНК CBS1538, сопоставленного с комбинированными геномами эталонных штаммов S . cerevisiae и S . eubayanus были преобразованы в отсортированные файлы BAM с помощью samtools, и данные были извлечены как количество прочтений/500 п.н., а затем нормализованы по размеру библиотеки (общее количество прочтений), чтобы получить предполагаемое количество копий хромосом.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.s006

(TXT)

Данные S3. Чтения из

de novo секвенирования ДНК W34/70, сопоставленного с комбинированными геномами эталонных штаммов S . cerevisiae и S . eubayanus были преобразованы в отсортированные файлы BAM с помощью samtools, и данные были извлечены как количество прочтений/500 п.н., а затем нормализованы по размеру библиотеки (общее количество прочтений), чтобы получить предполагаемое количество копий хромосом.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010149.s007

(TXT)

Благодарности

Мы благодарим основной центр геномных технологий и основной центр биоинформатики Манчестерского университета за помощь в анализе РНКсек и Яна Дональдсона за первоначальную биоинформационную поддержку.

Каталожные номера

  1. 1. Хорнси ИС. История пива и пивоварения. Кембридж, Великобритания: Королевское химическое общество; 2003.
  2. 2. Барнет Дж.А. История исследований дрожжей 2: Луи Пастер и его современники, 1850–1880 гг. Дрожжи. 2000;16(8):755–771. пмид:10861901
  3. 3. Монеравела С., Бонд У. Разжигание бури: геномы лагерных дрожжей и их эволюция. Биотехнология Adv. 2017;35(4):512–519. пмид:28284994
  4. 4.Данн Б., Шерлок Г. Реконструкция происхождения генома и эволюции гибридных лагерных дрожжей Saccharomyces pastorianus. Геном Res. 2008;18(10):1610–1623. пмид:18787083
  5. 5. Либкинд Д., Хиттингер С., Валерио Э., Гонсалвес С., Довер Дж., Джонстон М. и др. Одомашнивание микробов и идентификация дикого генетического фонда лагерных дрожжей. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2011;108(35):14539–14544. пмид:21873232
  6. 6.Перис Д., Лэнгдон К.К., Мориарти Р.В., Сильвестр К., Бонтрагер М., Чаррон Г. и др. Сложные предки гибридов лагерного пивоварения были сформированы постоянными вариациями диких дрожжей Saccharomyces eubayanus. Генетика PLoS. 2016;12(7):e1006155. пмид:27385107
  7. 7. Langdon QK, Peris D, Eizaguirre JI, Opulente DA, Buh KV, Sylvester K, et al. Послеледниковая миграция сформировала геномное разнообразие и глобальное распространение дикого предка лагерных гибридов. Генетика PLoS. 2020;16(4):e1008680.пмид:32251477
  8. 8. Эйсагирре Д.И., Перис Д., Родригес М.Е., Лопес К.А., Де Лос Риос П., Хиттингер К.Т. и др. Филогеография дикого предка пивоварения лагера (Saccharomyces eubayanus) в Патагонии. Окружающая среда микробиол. 2018;20(10):3732–3743. пмид:30105823
  9. 9. Бинг Дж., Хань П.Дж., Лю В.К., Ван К.М., Бай Ф.Ю. Доказательства дальневосточного азиатского происхождения пивных дрожжей для лагера. Карр Биол. 2014;24(10):R380–381. пмид:24845661
  10. 10. Алсаммар Х.Ф., Насиб С., Брансия Л.Б., Гилман Р.Т., Ван П., Делнери Д.Целевой метагеномный подход к учету биоразнообразия рода Saccharomyces в дикой среде. Environ Microbiol Rep. 2019;11(2):206–214. пмид:30507071
  11. 11. Крогерус К., Сеппанен-Лааксо Т., Кастильо С., Гибсон Б. Наследование фенотипов, имеющих отношение к пивоварению, в сконструированных гибридах Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces eubayanus. Факт микробной клетки. 2017;16(1):66. пмид:28431563
  12. 12. Бонд Ю., Нил С., Доннелли Д., Джеймс Т. Анеуплоидия и контрольные точки количества копий в геноме лагерных дрожжей, картированные с помощью гибридизации микрочипов.Текущая генетика. 2004;45(6):360–370. пмид:15103502
  13. 13. Kodama Y, Kielland-Brandt MC, Hansen J. Пивоваренные дрожжи Lager. В: Sunnerhagen P, Piskur J, редакторы. Сравнительная геномика. Темы современной генетики. 15. Берлин, Гейдельберг: Springer; 2006. с. 145–164.
  14. 14. Накао Ю., Канамори Т., Ито Т., Кодама Ю., Райниери С., Накамура Н. и др. Последовательность генома лагерных пивоваренных дрожжей, межвидового гибрида. Исследование ДНК 2009;16(2):115–129. пмид:19261625
  15. 15.Вальтер А., Хессельбарт А., Вендланд Дж. Геномная последовательность Saccharomyces carlsbergensis, первых в мире лагерных дрожжей с чистой культурой. G3 (Бетесда, Мэриленд). 2014;4(5):783–793. пмид:24578374
  16. 16. Дрожжи Wendland J. Lager достигают совершеннолетия. Эукариотическая клетка. 2014;13(10):1256–1265. пмид:25084862
  17. 17. Хьюитт С.К., Дональдсон И.Дж., Ловелл С.К., Делнери Д. Секвенирование и характеристика перестроек в трех штаммах S. pastorianus выявляет наличие химерных генов и свидетельствует о повторном использовании точки разрыва.ПЛОС Один. 2014;9(3):e92203. пмид:24643015
  18. 18. Барнетт Дж.А., Лихтенталер Ф.В. История исследования дрожжей 3: Эмиль Фишер, Эдуард Бюхнер и их современники, 1880–1900 гг. Дрожжи. 2001;18(4):363–388. пмид:11223946
  19. 19. Monerawela C, Bond U. Гибридные геномы Saccharomyces pastorianus: современная перспектива. Дрожжи. 2018;35(1):39–50. пмид:28787090
  20. 20. Салазар А.Н., Гортер де Врис А.Р., ван ден Брук М., Брауэрс Н., де ла Торре Кортес П., Куиджперс НГА и др.Сборка на хромосомном уровне и сравнительный анализ генома подтверждают, что лагерные дрожжи произошли от единственной гибридизации. Геномика BMC. 2019;20(1): pmid:317
  21. 21. Monerawela C, Bond U. Сайты рекомбинации на гибридных хромосомах S. pastorianus имеют общие мотивы последовательности и определяют сложные эволюционные отношения между лагерными дрожжами групп I и II. Исследование дрожжей FEMS. 2017;17(5):
  22. 22. Monerawela C, James TC, Wolfe KH, Bond U. Потеря специфических для лагера генов и субтеломерных областей определяет две разные линии Saccharomyces cerevisiae для штаммов Saccharomyces pastorianus Group I и II.FEMS Yeast Res. 2015;15(2): pmid:25673756
  23. 23. Окуно М., Кадзитани Р., Рюсуи Р., Моримото Х., Кодама Й., Ито Т. Анализ последовательности штаммов дрожжей для лагерных пивоварен следующего поколения раскрывает эволюционную историю межвидовой гибридизации. Исследования ДНК. 2016;23(1):67–80. пмид:26732986
  24. 24. Гибсон Б.Р., Сторгардс Э., Крогерус К., Видгрен В. Сравнительная физиология и эффективность ферментации штаммов лагерных дрожжей Saaz и Frohberg и родительских видов Saccharomyces eubayanus.Дрожжи. 2013;30(7):255–266. пмид:23695993
  25. 25. Ried T, Meijer G, Harrison DJ, Grechd G, Franch-Expósitoe S, Briffacd R, et al. Ландшафт изменений числа копий генома при колоректальном раке и их последствия для уровней экспрессии генов и исхода заболевания. Молекулярные аспекты медицины. 2019; 69, (октябрь 2019 г.): 48–61. пмид:31365882
  26. 26. Павелка Н., Ранкати Г., Чжу Дж., Брэдфорд В.Д., Сараф А., Флоренс Л. и др. Анеуплоидия вызывает количественные изменения протеома и фенотипическую изменчивость у почкующихся дрожжей.Природа. 2010;468(7321):321–325. пмид:20962780
  27. 27. Sheltzer JM, Torres EM, Dunham MJ, Amon A. Транскрипционные последствия анеуплоидии. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(31):12644–12649. пмид:22802626
  28. 28. Торрес Э.М., Сокольский Т., Такер К.М., Чан Л.И., Боселли М., Данхэм М.Дж. и соавт. Влияние анеуплоидии на клеточную физиологию и деление клеток у гаплоидных дрожжей. Наука. 2007;317(5840):916–924. пмид:17702937
  29. 29. Пятковска Э.М., Насиб С., Найт Д., Делнери Д.Химерные белковые комплексы у гибридных видов генерируют новые фенотипы. Генетика PLoS. 2013;9(10): pmid:24137105
  30. 30. Олесен К., Фелдинг Т., Гьермансен С., Хансен Дж. Динамика транскриптома пивоваренных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis во время брожения лагерного пива в промышленных масштабах. FEMS Yeast Res. 2002;2(4):563–573. пмид:12702272
  31. 31. Джеймс Т.К., Кэмпбелл С., Доннелли Д., Бонд У. Профиль транскрипции пивных дрожжей в условиях ферментации.Журнал прикладной микробиологии. 2003; 94: 432–448. пмид:12588552
  32. 32. Джеймс Т.К., Кэмпбелл С.Г., Бонд У.М. Сравнительный анализ глобальной экспрессии генов у лагерных и лабораторных штаммов дрожжей, выращенных в сусле. Труды IEEE. 2002; 90: 1887–1899.
  33. 33. Смарт КА. Геномы пивоваренных дрожжей, полногеномная экспрессия и профилирование протеома во время ферментации. Дрожжи. 2007;24(11):993–1013. пмид:17879324
  34. 34. Хориноучи Т., Йошикава К., Кавайде Р., Фурусава С., Накао Ю., Хирасава Т. и др.Полногеномный анализ экспрессии ортологичных генов Saccharomyces pastorianus с использованием олигонуклеотидных микрочипов. J Biosci Bioeng. 2010;110(5):602–607. пмид:20547377
  35. 35. Сомани А., Бокс В.Г., Смарт К.А., Пауэлл К.Д. Физиологический и транскриптомный ответ Saccharomyces pastorianus на хранение в холодильнике. FEMS Yeast Res. 2019;19(4): pmid:31073596
  36. 36. Сюй В., Ван Дж., Ли К. Сравнительный протеомный и транскриптомный анализ лагерных пивных дрожжей в процессе автолиза.FEMS Yeast Res. 2014;14(8):1273–1285. пмид:25345722
  37. 37. Timouma S, Balarezo-Cisneros LN, Pinto J, De La Cerda R, Bond U, Schwartz JM, et al. Транскрипционный профиль промышленного гибрида Saccharomyces pastorianus выявляет зависящее от температуры смещение экспрессии аллелей и предпочтительные сборки ортологичных белков. Мол Биол Эвол. 2021;38(12):5437–5452. пмид:34550394
  38. 38. Timouma S, Schwartz JM, Delneri D. HybridMine: конвейер для предсказания наследования аллелей и количества копий генов в гибридных геномах и его применение к промышленным дрожжам.Микроорганизмы. 2020;8(10):1554–1569. пмид:33050146
  39. 39. Magalhaes F, Vidgren V, Ruohonen L, Gibson B. Утилизация мальтозы и мальтотриозы штаммами группы I гибридных лагерных дрожжей Saccharomyces pastorianus. FEMS Yeast Res. 2016;16(5):
  40. 40. Видгрен В., Лондонсборо Дж. Характеристика переносчика AGT1 типа Saccharomyces bayanus лагерных дрожжей. Журнал института пивоварения. 2012;118(2):148–151.
  41. 41. Видгрен В., Руохонен Л., Лондсборо Дж.Характеристика и функциональный анализ локусов MAL и MPH для утилизации мальтозы в некоторых штаммах элевых и лагерных дрожжей. Appl Environ Microbiol. 2005;71(12):7846–7857. пмид:16332759
  42. 42. ван ден Брук М., Болат И., Нейкамп Дж. Ф., Рамос Э., Луттик М. А., Купман Ф. и соавт. Изменение числа копий хромосом у Saccharomyces pastorianus является свидетельством обширной динамики генома в штаммах для пивоварения промышленных лагеров. Appl Environ Microbiol. 2015;81(18):6253–6267. пмид:26150454
  43. 43.Джеймс Т., Ашер Дж., Кэмпбелл С., Бонд У. Лагерные дрожжи обладают динамическими геномами, которые подвергаются перестройкам и амплификации генов в ответ на стресс. Текущая генетика. 2008;53(3):139–152. пмид:18183398
  44. 44. Хаймович Г., Медина Д.А., Кос С.З., Гарбер М., Миллан-Замбрано Г., Баркай О. и соавт. Экспрессия генов циклична: факторы деградации мРНК также способствуют синтезу мРНК. Клетка. 2013;153(5):1000–1011. пмид:23706738
  45. 45. Sun M, Schwalb B, Pirkl N, Maier KC, Schenk A, Failmezger H, et al.Общий анализ деградации мРНК эукариот выявляет Xrn1-зависимую буферизацию уровней транскриптов. Мол Ячейка. 2013;52(1):52–62. пмид:24119399
  46. 46. Осли М.А., Херефорд Л.М. Гены гистонов дрожжей проявляют дозовую компенсацию. Клетка. 1981;24(2):377–384. пмид:7016340
  47. 47. Торрес Э.М., Спрингер М., Амон А. Нет текущих доказательств широко распространенной дозовой компенсации у S. cerevisiae. Элиф. 2016;5:e10996. пмид:26949255
  48. 48. Керол А., Баррио Э., Рамон Д.Сравнительное исследование различных методов характеристики штаммов дрожжей. Систематическая и прикладная микробиология. 1992;15(3):439–446.
  49. 49. Лангмид Б., Зальцберг С.Л. Быстрое выравнивание с промежутками чтения с помощью Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9(4):357–359. пмид:22388286
  50. 50. Martin M. Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из операций высокопроизводительного секвенирования. Журнал EMBnet. 2011;17(1):10–12.
  51. 51. Ли Х., Хэндсакер Б., Высокер А., Феннелл Т., Руан Дж., Гомер Н. и др.Формат выравнивания/карты последовательностей и SAMtools. Биоинформатика. 2009;25(16):2078–2079. пмид:19505943
  52. 52. Арес М. Выделение тотальной РНК из культур дрожжевых клеток. Протокол Колд-Спринг-Харб. 2012; 2012(10):1082–1086. пмид:23028070
  53. 53. Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренков Дж., Залески С., Джа С. и соавт. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика. 2013;29(1):15–21. пмид:23104886
  54. 54. Ляо Ю, Смит Г.К., Ши В.featureCounts: эффективная программа общего назначения для назначения чтений последовательностей геномным признакам. Биоинформатика. 2014;30(7):923–930. пмид:24227677
  55. 55. Ge SX, Son EW, Yao R. iDEP: интегрированное веб-приложение для дифференциальной экспрессии и анализа путей данных RNA-Seq. Биоинформатика BMC. 2018;19(1): pmid:30567491
  56. 56. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A, et al. ClueGO: подключаемый модуль Cytoscape для расшифровки функционально сгруппированных сетей онтологии генов и аннотаций путей.

alexxlab / 04.05.1996 / Знак

Добавить комментарий

Почта не будет опубликована / Обязательны для заполнения *