Можно ли переходить дорогу наискосок: Можно ли пешеходам переходить перекресток по диагонали? | ГИБДД | Авто

Dover — Управление дорожной безопасности штата Делавэр (OHS) задает людям извечный вопрос: «Почему курица перешла дорогу?» Но вместо , почему , они хотят знать , как курица перешла дорогу, и надеются, что люди будут внимательно отвечать.Существует повышенный риск дорожно-транспортных происшествий с пешеходами в летние месяцы, когда больше людей путешествует и население курортной зоны увеличивается. Вот почему OHS снова объединилась с DelDOT, чтобы обучать пешеходов и поощрять их принимать разумные и безопасные решения при ходьбе по проезжей части.

С 1 января ^-го этого года 12 пешеходов погибли в дорожно-транспортных происшествиях в Делавэре. Это число больше, чем в это время в прошлом году, когда погибло всего 8 пешеходов.Это особенно тревожно, потому что сейчас только середина года, а еще впереди осенний сезон — время года, когда световой день становится короче, а солнечные блики становятся проблемой, что повышает риск большего числа аварий пешеходов и транспортных средств.

Новая пешеходная кампания в округах Нью-Касл и Кент будет включать курицу, переходящую дорогу, которая указывает, как и где безопасно переходить. Платные средства массовой информации будут включать рекламу автобусов DART, цифровую рекламу и дверные вешалки для домов вдоль дорог с высокой аварийностью.

OHS продолжит инициативу по организации пешеходных переходов от пляжа к пляжу вместе с Ocean City Maryland, на котором изображен счастливый краб. Платные средства массовой информации включают вывески на стендах спасателей, в аутлетах Tanger и на Jolly Trolley. OHS будет сотрудничать с городами для проведения проверок безопасности пешеходов, чтобы предоставить советы и информацию о безопасных прогулках. Первое мероприятие состоится на пляже Саут-Бетани в пятницу 3 июля, ^-е, .

OHS продолжит образовательные патрули по безопасности пешеходов с полицейским управлением Бетани-Бич, полицейским управлением Дьюи-Бич, полицейским управлением острова Фенвик, полицейским управлением округа Нью-Касл, полицейским управлением Ньюарк, полицейским управлением Рехобот-Бич, С.Полицейское управление Бетани Бич, Полицейское управление Уилмингтона и Войска DSP 2, 6 и 7. Эти патрули в составе двух офицеров будут происходить в выходные дни, запланированные на июнь, июль, август и сентябрь. Офицеры будут патрулировать места крушения пешеходов с высокой пешеходной зоной, чтобы выявить пешеходов, которые рискуют попасть в аварию, например тех, кто не пересекает обозначенные пешеходные переходы или обозначенные перекрестки, ходят в сумерках / ночью без светоотражающих элементов или фонарика или люди с ограниченными возможностями при ходьбе. Офицеры остановят пешехода, чтобы обучить его безопасному передвижению в условиях дорожного движения, а также предоставят им информационный флаер и светоотражающий рюкзак.

В конечном счете, официальные лица по безопасности дорожного движения и их партнеры соглашаются, что решение проблемы потребует активного участия и поддержки со стороны как автомобильной общественности, так и пешеходов. Следуя этим основным советам по безопасности и законам о пешеходах, каждый может научиться ходить с умом.

• Переходить только на пешеходных переходах или перекрестках с сигналами или дорожными знаками. Посмотрите налево, направо и снова налево. Начинайте переходить дорогу только тогда, когда ясно.
• Не рискуйте переходить за пределы пешеходного перехода или перекрестка только потому, что так удобнее, особенно на высокоскоростных дорогах.Машины не могут вовремя остановиться за вас.
• Используйте тротуары. Если тротуара нет, идите навстречу движению и как можно дальше от края дороги.
• Не выходите на пешеходный переход, если это создаст опасность для автомобилистов. Когда станет ясно, что нужно переходить, продолжайте следить за движением транспорта, переходя улицу, пока не дойдете до другой стороны.
• Носите фонарик или другой светоотражающий предмет при ходьбе ночью. Это закон.
• Учите детей не выбегать на улицу за мячами или другими игрушками и не позволяйте им переходить дорогу в одиночку, пока вы не освоите с ними основы.
• Не ходите в состоянии алкогольного или наркотического опьянения. Нарушение ходьбы похоже на нарушение вождения; это незаконно и может быть смертельно опасным.
• Если ваш автомобиль сломался на межгосударственном или загруженном шоссе, не выходите из него. Вместо этого позвоните по номеру 77 или 911 для получения помощи. Автомобилисты также могут позвонить по номеру 77, чтобы сообщить об отключенном транспортном средстве, которое они видят на проезжей части.
• Если вы за рулем, остерегайтесь пешеходов у проезжей части.

Чтобы получить дополнительную информацию о кампании Walk Smart и найти материалы о советах и ​​законах по безопасности пешеходов, посетите сайт http: // ohs.delaware.gov/pedestrian.shtml, подпишитесь на нас в Twitter @DEHighwaySafe или на Facebook на ArriveAliveDE.

Связанные темы: пешеходные переходы, пешеходы, безопасность пешеходов, пешеходы, контроль дорожного движения, безопасность дорожного движения

Будьте в курсе, получая ежедневный дайджест по электронной почте около полудня с последними новостными выпусками от государственных агентств на news.delaware.gov.

Здесь вы можете подписаться на последующие обновления новостей.

Dover — Управление дорожной безопасности штата Делавэр (OHS) задает людям извечный вопрос: «Почему курица перешла дорогу?» Но вместо , почему , они хотят знать , как курица перешла дорогу, и надеются, что люди будут внимательно отвечать.Существует повышенный риск дорожно-транспортных происшествий с пешеходами в летние месяцы, когда больше людей путешествует и население курортной зоны увеличивается. Вот почему OHS снова объединилась с DelDOT, чтобы обучать пешеходов и поощрять их принимать разумные и безопасные решения при ходьбе по проезжей части.

С 1 января ^-го этого года 12 пешеходов погибли в дорожно-транспортных происшествиях в Делавэре. Это число больше, чем в это время в прошлом году, когда погибло всего 8 пешеходов.Это особенно тревожно, потому что сейчас только середина года, а еще впереди осенний сезон — время года, когда световой день становится короче, а солнечные блики становятся проблемой, что повышает риск большего числа аварий пешеходов и транспортных средств.

Новая пешеходная кампания в округах Нью-Касл и Кент будет включать курицу, переходящую дорогу, которая указывает, как и где безопасно переходить. Платные средства массовой информации будут включать рекламу автобусов DART, цифровую рекламу и дверные вешалки для домов вдоль дорог с высокой аварийностью.

OHS продолжит инициативу по организации пешеходных переходов от пляжа к пляжу вместе с Ocean City Maryland, на котором изображен счастливый краб. Платные средства массовой информации включают вывески на стендах спасателей, в аутлетах Tanger и на Jolly Trolley. OHS будет сотрудничать с городами для проведения проверок безопасности пешеходов, чтобы предоставить советы и информацию о безопасных прогулках. Первое мероприятие состоится на пляже Саут-Бетани в пятницу 3 июля, ^-е, .

OHS продолжит образовательные патрули по безопасности пешеходов с полицейским управлением Бетани-Бич, полицейским управлением Дьюи-Бич, полицейским управлением острова Фенвик, полицейским управлением округа Нью-Касл, полицейским управлением Ньюарк, полицейским управлением Рехобот-Бич, С.Полицейское управление Бетани Бич, Полицейское управление Уилмингтона и Войска DSP 2, 6 и 7. Эти патрули в составе двух офицеров будут происходить в выходные дни, запланированные на июнь, июль, август и сентябрь. Офицеры будут патрулировать места крушения пешеходов с высокой пешеходной зоной, чтобы выявить пешеходов, которые рискуют попасть в аварию, например тех, кто не пересекает обозначенные пешеходные переходы или обозначенные перекрестки, ходят в сумерках / ночью без светоотражающих элементов или фонарика или люди с ограниченными возможностями при ходьбе. Офицеры остановят пешехода, чтобы обучить его безопасному передвижению в условиях дорожного движения, а также предоставят им информационный флаер и светоотражающий рюкзак.

В конечном счете, официальные лица по безопасности дорожного движения и их партнеры соглашаются, что решение проблемы потребует активного участия и поддержки со стороны как автомобильной общественности, так и пешеходов. Следуя этим основным советам по безопасности и законам о пешеходах, каждый может научиться ходить с умом.

• Переходить только на пешеходных переходах или перекрестках с сигналами или дорожными знаками. Посмотрите налево, направо и снова налево. Начинайте переходить дорогу только тогда, когда ясно.
• Не рискуйте переходить за пределы пешеходного перехода или перекрестка только потому, что так удобнее, особенно на высокоскоростных дорогах.Машины не могут вовремя остановиться за вас.
• Используйте тротуары. Если тротуара нет, идите навстречу движению и как можно дальше от края дороги.
• Не выходите на пешеходный переход, если это создаст опасность для автомобилистов. Когда станет ясно, что нужно переходить, продолжайте следить за движением транспорта, переходя улицу, пока не дойдете до другой стороны.
• Носите фонарик или другой светоотражающий предмет при ходьбе ночью. Это закон.
• Учите детей не выбегать на улицу за мячами или другими игрушками и не позволяйте им переходить дорогу в одиночку, пока вы не освоите с ними основы.
• Не ходите в состоянии алкогольного или наркотического опьянения. Нарушение ходьбы похоже на нарушение вождения; это незаконно и может быть смертельно опасным.
• Если ваш автомобиль сломался на межгосударственном или загруженном шоссе, не выходите из него. Вместо этого позвоните по номеру 77 или 911 для получения помощи. Автомобилисты также могут позвонить по номеру 77, чтобы сообщить об отключенном транспортном средстве, которое они видят на проезжей части.
• Если вы за рулем, остерегайтесь пешеходов у проезжей части.

Чтобы получить дополнительную информацию о кампании Walk Smart и найти материалы о советах и ​​законах по безопасности пешеходов, посетите сайт http: // ohs.delaware.gov/pedestrian.shtml, подпишитесь на нас в Twitter @DEHighwaySafe или на Facebook на ArriveAliveDE.

Связанные темы: пешеходные переходы, пешеходы, безопасность пешеходов, пешеходы, контроль дорожного движения, безопасность дорожного движения

Будьте в курсе, получая ежедневный дайджест по электронной почте около полудня с последними новостными выпусками от государственных агентств на news.delaware.gov.

Здесь вы можете подписаться на последующие обновления новостей.

9. НАКЛОННЫЙ ВИД, ЧАСТИЧНЫЙ ЗАПАДНЫЙ ПРОЛЕТ, С ЮГО-ЗАПАДА, ПОКАЗЫВАЮЩИЕ ПАНЕЛИ ФЕРМ И ТВЕРДУЮ КОНФИГУРАЦИЮ УЧАСТНИКОВ ФЕРМ, ВКЛЮЧАЯ ПОЛИГОНАЛЬНЫЙ ВЕРХНИЙ ХОРД, ВЕРТИКАЛЬНЫЕ И ДИАГОНАЛЬНЫЕ УПРАВЛЯЮЩИЕ И КРОСС-СТРЕЙТЫ

{ ссылка: "https://www.loc.gov/pictures/item/md1334.photos.320161p/", thumbnail: { url: "// cdn.loc.gov/service/pnp/habshaer/md/md1300/md1334/photos/320161p_150px.jpg", alt: 'Изображение из онлайн-каталога эстампов и фотографий - Библиотека Конгресса' } , download_links: [ { ссылка: "// cdn.loc.gov/service/pnp/habshaer/md/md1300/md1334/photos/320161p_150px.jpg ", label: 'Маленькое изображение / gif', meta: 'Нет [7kb]' } , { ссылка: "// cdn.loc.gov/service/pnp/habshaer/md/md1300/md1334/photos/320161pr.jpg", label: 'Среднее изображение / jpg', meta: 'Нет [63kb]' } , { ссылка: "// cdn.loc.gov/service/pnp/habshaer/md/md1300/md1334/photos/320161pv.jpg", label: 'Большое изображение / jpg', meta: 'Нет [142kb]' } , { ссылка: "// cdn.loc.gov/master/pnp/habshaer/md/md1300/md1334/photos/320161pu.tif ", label: 'Изображение большего размера / tif', meta: 'Нет [19,1 МБ]' } ] }

9. ОБЩИЙ ВИД, ЧАСТИЧНЫЙ ЗАПАДНЫЙ ПРОЛЕТ, С ЮГО-ЗАПАДА, ПОКАЗЫВАЮЩИЕ ФЕРМОВЫЕ ПАНЕЛИ И ТВЕРДУЮ КОНФИГУРАЦИЮ УЧАСТНИКОВ ФЕРМ, ВКЛЮЧАЯ ПОЛИГОНАЛЬНЫЙ ВЕРХНИЙ ХОРД, ВЕРТИКАЛЬНЫЕ И ДИАГОНАЛЬНЫЕ УЧАСТНИКИ, И КРОСС-СТРУТС, Мост через Глендейл-Роуд, Глендейл-Роуд МакГенри, округ Гаррет, Мэриленд

• Название: 9.ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ ВИД, ЧАСТИЧНЫЙ ЗАПАДНЫЙ ПРОЛЕТ, С ЮГО-ЗАПАДА, ПОКАЗЫВАЮЩИЕ ПАНЕЛИ ФЕРМ И ТВЕРДНУЮ КОНФИГУРАЦИЮ УЧАСТНИКОВ ФЕРМ, ВКЛЮЧАЯ ПОЛИГОНАЛЬНЫЙ ВЕРХНИЙ ХОРД, ВЕРТИКАЛЬНЫЕ И ДИАГОНАЛЬНЫЕ УЧАСТНИКИ, И КРОСС-СТРУТЫ — Глендейл-Роуд-Бридж, Глендейл-Роуд-Бридж, Гендл-Крик-Роуд, Спаннинг Графство, Мэриленд
• Средний: 4 x 5 дюймов
• Номер репродукции: HAER MD, 12-MHEN.V, 1-9
• Информация о правах: Нет известных ограничений на изображения, сделанные правительством США; изображения, скопированные из других источников, могут быть ограничены. (http://www.loc.gov/rr/print/res/114_habs.html)
  
• Телефонный номер: HAER MD, 12-MHEN.V, 1—9
• Репозиторий: Отдел эстампов и фотографий Библиотеки Конгресса Вашингтон, округ Колумбия 20540 США http://hdl.loc.gov/loc.pnp/pp.Распечатать
• Место:
• Широта / Долгота: 39.50391, -793116834
• Коллекции:
• Добавить в закладки эту запись:
  https: // www.loc.gov/pictures/item/md1334.photos.320161p/

Обследование исторических американских зданий / Исторические американские инженерные рекорды / Обследование исторических американских ландшафтов

Библиотека Конгресса, как правило, не владеет правами на материалы в свои коллекции и, следовательно, не может предоставить или отказать в разрешении на публиковать или иным образом распространять материал. Для дальнейших прав информацию см. в разделе «Информация о правах» ниже, а также о правах и Страница информации об ограничениях ( http: // www.loc.gov/rr/print/res/rights.html ).

• Информация о правах человека : Нет известных ограничений на изображения, сделанные правительством США; изображения, скопированные из других источников, могут быть ограничены. http://www.loc.gov/rr/print/res/114_habs.html
• Номер репродукции : HAER MD, 12-MHEN.V, 1—9
• Телефонный номер : HAER MD, 12-MHEN.V, 1—9
• Средний : 4 x 5 дюймов

Если отображаются цифровые изображения

Вы можете сами загружать изображения из Интернета. Кроме того, вы можете приобрести копии различных типов через Службу тиражирования Библиотеки Конгресса.

HABS / HAER / HALS, как правило, отсканированы с высоким разрешением, которое подходит для большинства публикационных целей (дополнительные сведения о цифровых изображениях см. В разделе «Оцифровка коллекции»).

• Фотографии — Все фотографии печатаются из цифровых файлов, чтобы сохранить хрупкие оригиналы.
• Запишите номер вызова и номер позиции, которые отображаются под фотографией в режиме отображения нескольких изображений (например, HAER, NY, 52-BRIG, 4-2).
• Если возможно, приложите распечатку фотографии.
• Рисунки — Все рисунки печатаются из цифровых файлов, чтобы сохранить хрупкие оригиналы.
• Запишите номер опроса (например, HAER NY — 143) и номер листа (например, «Лист 1 из 4»), которые указаны на краю чертежа.(ПРИМЕЧАНИЕ. Эти числа отображаются на экране Tiff «Контрольное изображение».)
• Если возможно, приложите распечатку чертежа.
• Страницы данных
• Запишите номер вызова в записи каталога.

Если цифровые изображения не отображаются

В том редком случае, когда цифровое изображение для документации HABS / HAER / HALS не отображается в Интернете, выберите изображения для воспроизведения одним из следующих способов:

• Посетите читальный зал эстампов и фотографий и запросите просмотр группы (общая информация об услугах в читальном зале доступна по адресу: http: // www.loc.gov/rr/print/info/001_ref.html). Лучше всего заранее связаться со справочным персоналом (см. Http://www.loc.gov/rr/print/address.html), чтобы убедиться, что материал находится на сайте. ИЛИ
• Персонал читального зала P&P может предоставить до 15 быстрых копий предметов в течение календарного года (многие оригинальные предметы в фондах слишком старые или хрупкие для изготовления таких копий, но, как правило, материалы HABS / HAER / HALS находятся в достаточно хорошем состоянии, чтобы их можно было разместить на копировальных аппаратах). Чтобы получить помощь, посетите нашу страницу «Задайте вопрос библиотекарю» ИЛИ
• Нанять внештатного исследователя, который сделает за вас дальнейший выбор (список исследователей доступен по адресу: http: // www.loc.gov/rr/print/resource/013_pic.html).
• Вы можете приобрести копии различных типов, в том числе быстрые копии, через Службы тиражирования Библиотеки Конгресса (прайс-листы, контактная информация и формы заказа для Служб тиражирования Библиотеки Конгресса доступны на веб-сайте Службы тиражирования):
• Запишите номер вызова, указанный выше.
• Посмотрите на поле Medium выше. Если в нем указано более одного элемента:
• Всю группу можно заказать в виде ксерокопий или высококачественных копий.
• Все элементы на определенном носителе (например, все рисунки, все фотографии) можно заказать в виде ксерокопий или копий в высоком качестве.

• Телефонный номер: HAER MD, 12-MHEN.V, 1—9
• Средний: 4 x 5 дюймов

Выполните следующие действия, чтобы определить, нужно ли вам заполнить квитанцию ​​о звонке в Читальном зале эстампов и фотографий для просмотра оригинального товара (ов).В некоторых случаях суррогатный (замещающее изображение) доступно, часто в виде цифрового изображение, копия оттиска или микрофильма.

1. Оцифрован ли элемент? (Уменьшенное (маленькое) изображение будет быть видимым слева.)

   • Да, товар оцифрован. Пожалуйста, используйте цифровое изображение вместо того, чтобы запрашивать оригинал. Все изображения можно просматривать в большом размере когда вы находитесь в любом читальном зале Библиотеки Конгресса.В некоторых случаях доступны только эскизы (маленькие) изображения. когда вы находитесь за пределами Библиотеки Конгресса, потому что элемент ограничен в правах или не оценивался ограничения прав.

     В качестве меры по сохранению мы обычно не обслуживаем оригинал при наличии цифрового изображения. если ты есть веские причины посмотреть оригинал, проконсультируйтесь с библиотекарь-справочник. (Иногда оригинал просто слишком хрупкий, чтобы служить.Например, стеклянные и пленочные фотографические. негативы особенно подвержены повреждению. Они также легче увидеть в Интернете, где они представлены как положительные изображений.)

   • Нет, товар не оцифрован. Пожалуйста, перейдите к # 2.

2. Указывают ли приведенные выше поля с рекомендациями по доступу или номер телефона, что существует нецифровой суррогат, такой как микрофильм или копии?

   • Да, существует еще один суррогат. Справочный персонал может направить вас к этому суррогату.

   • Нет, другого суррогата не существует. Пожалуйста, перейдите к # 3.

3. Если вы не видите уменьшенное изображение или ссылку на другой суррогатная мать, пожалуйста, заполните квитанцию ​​о звонке в разделе «Распечатки и фотографии». Читальный зал. Во многих случаях оригиналы можно подавать в несколько минут. Другие материалы требуют предварительной записи на потом. в тот же день или в будущем.Справочный персонал может проконсультировать вас в как заполнить квитанцию ​​о звонках, так и когда товар может быть подан.

Чтобы связаться с сотрудниками справочной службы в Зале эстампов и фотографий, воспользуйтесь нашей службой «Спросите библиотекаря» или позвоните в читальный зал с 8:30 до 5:00 по телефону 202-707-6394 и нажмите 3.

Отрицательное отражение и преобразование отрицательной поверхностной волны из наклонно падающих электромагнитных волн

Анизотропная кодирующая метаповерхность с наклонным падением и конструкция кодирующих частиц

Анизотропная кодирующая метаповерхность может быть классифицирована как тип бифункциональной кодирующей метаповерхности, которая выполняет две разные функции.Двойные функции могут быть реализованы либо за счет ортогональности поляризаций, либо на разных частотах, что позволяет ему функционировать как поляризационно-зависимая метаповерхность анизотропного кодирования ³⁹ и частотно-зависимая бифункциональная метаповерхность ⁴¹ кодирования, соответственно. Группа профессора Чжоу разработала высокоэффективную широкополосную мета-голограмму с двойными изображениями с контролируемой поляризацией с использованием наноантенн с золотым крестом ⁴² . Бифункциональность происходит, по существу, из геометрической анизотропии кодирующей частицы, которая позволяет каждой кодирующей частице иметь независимые состояния кодирования при поляризациях x- и y- .Чтобы четко понять метаповерхности анизотропного кодирования, мы проиллюстрируем принцип работы на дополнительном рисунке S1, предоставив пример простой 1-битной матрицы анизотропного кодирования [1/1, 1/0; 0/1, 0/0], в котором цифры до и после косой черты представляют собой кодовые цифры под поляризациями x- и y , соответственно.

Рисунок 1 демонстрирует независимое управление электромагнитными волнами как в пространственных, так и в волновых режимах анизотропной кодирующей метаповерхности при наклонном падении.Метаповерхность состоит из массива анизотропных кодирующих частиц, как показано на рис. 1a и 1b. Поскольку каждая кодирующая частица имеет двойные состояния кодирования, шаблон кодирования метаповерхности зависит от поляризации наклонного освещения (см. Луч красного света). Спроектирована ли метаповерхность анизотропного кодирования для управления PW или SW, определяется шаблоном кодирования. На рисунках 1c и 1d показано двойное манипулирование наклонно падающей волной в режиме PW. Для поляризации TM наклонное падение аномально отражается в правую сторону (рисунок 1c), в то время как оно перенаправляется в левую сторону для поляризации TE (рисунок 1d).Хорошо известно, что отраженная волна должна быть на противоположной стороне падающей волны по отношению к нормали к поверхности для обычного зеркального отражения. Однако при правильной последовательности кодирования градиента отраженный и падающий лучи могут находиться на одной и той же стороне нормали к поверхности (рис. 1d), что приводит к экзотическому явлению отрицательного отражения ^{43, 44} . Отметим, что отрицательное отражение ранее экспериментально не демонстрировалось. Рисунки 1e и 1f иллюстрируют независимые манипуляции с УВ при одинаковом наклонном падении.Из-за меньшего периода схемы градиентного кодирования наклонно падающие волны преобразуются в УВ, распространяющиеся в направлении — y — (рисунок 1e) и — x — направлении (рисунок 1f) для поляризаций TM и TE. , соответственно. Примечательно, что УВ на Рисунке 1f распространяется в обратном направлении по отношению к направлению наклонного падения, в результате чего возникает отрицательная поверхностная волна, что довольно противоречит тому, что происходит при обычных преобразованиях пространственной волны в поверхностную.В следующих разделах мы продемонстрируем такие экзотические явления на конкретных примерах.

Схематическая иллюстрация метаповерхности анизотропного кодирования при управлении как PW, так и SW при наклонных падениях, а также структурный дизайн метаповерхности анизотропного кодирования. ( a ) Схема метаповерхности анизотропного кодирования при наклонном освещении. ( b ) Дизайн структуры анизотропной кодирующей частицы. ( c , d ) Независимые манипуляции с пространственными волнами под TM и TE поляризациями, включая отрицательное отражение.( e , f ) Независимые манипуляции с УВ при поляризациях TM и TE, включая отрицательные УВ.

Для этой цели мы вводим новую структуру как анизотропную кодирующую частицу, которая создается путем печати металлического листа эллиптической формы на верхней поверхности коммерческой подложки FR4 толщиной d = 2 мм и постоянной решетки L. = 6 мм, как показано на рисунке 1b. Задняя поверхность подложки полностью покрыта слоем меди, чтобы гарантировать полное отражение и нулевое пропускание.Металлическая структура в форме эллипса получается путем масштабирования круглого диска радиусом r в направлении x или y с коэффициентом масштабирования k , а затем сохранением металлического рисунка в пределах квадрата подложки. . Поскольку для характеристики геометрии кодирующей частицы требуются только два параметра, вычислительная сложность для оптимизации параметров 16 кодирующих частиц эффективно снижается. На дополнительном рисунке S2 показаны положения 16 оптимизированных кодирующих частиц на фазовой диаграмме отражения, с горизонтальной и вертикальной осями, представляющими фазы отражения под поляризациями x и y , соответственно.Подробные геометрические параметры для каждой кодирующей частицы приведены в таблице 1. Из дополнительного рисунка S2 видно, что фазы отражения при поляризации x (число перед косой чертой) в каждом столбце остаются постоянными и не имеют значения. в цифровые состояния при поляризации y (число после косой черты). Это также верно, когда мы смотрим на них из каждой строки, соответствующие независимым цифровым состояниям при поляризации x .Чтобы четко понять характеристики предлагаемой эллиптической кодирующей анизотропной частицы, мы выполняем серию моделирования с различными геометрическими параметрами и углами падения, как показано на дополнительном рис. S3. Такая простая структура всего с двумя параметрами настройки может обеспечить достаточный охват фазы и отличную амплитуду при двух ортогональных поляризациях и устойчива при наклонном падении. В отличие от ранее предложенных метаповерхностей кодирования ^{, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,} , которые имеют изотропные конструкции, независимые состояния кодирования при ортогональных поляризациях позволяют нам кодировать двойные функции для одной метаповерхности.

Независимое управление пространственными волнами с внеплоскостным отражением и отрицательным отражением

Мы демонстрируем бифункциональные характеристики метаповерхности анизотропного кодирования при управлении PW при косом падении. Первая матрица анизотропного кодирования M ₁ состоит из 32 × 32 кодирующих частиц, которые получаются путем комбинирования последовательностей субкодирования с поляризациями TM и TE.M ₁ предназначен для перенаправления наклонных падений TM и TE в аномальных направлениях. Здесь мы отметим, что TE и TM поляризации используются для идентификации направлений поляризации электрических полей для наклонного падения и мод УВ. TE и TM поляризации указывают на случаи, когда электрическое и магнитное поля параллельны плоскости метаповерхности соответственно. Мы вводим суперъединичную ячейку (массив из N × N идентичных кодирующих частиц) в кодирующую метаповерхность, чтобы уменьшить нежелательное электромагнитное взаимодействие между соседними кодирующими частицами, имеющими разную геометрию.Преимущества сверхъединичной ячейки были четко описаны в предыдущих работах ^{29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 41} . Еще одна причина использования сверхъединичной ячейки заключается в том, что она позволяет нам управлять направлением излучения отраженного луча, изменяя период кодирующей последовательности. Мы рассматриваем случай, когда плоская волна падает на метаповерхности под углом 18,2 ° относительно оси z , как показано на рисунках 2a и 2b. Ожидается, что диаграммы направленности при обеих поляризациях будут наклонены в направлении — y — на θ _r = 18.2 °.

Смоделированные трехмерные и двумерные диаграммы рассеяния в дальней зоне метаповерхности, закодированные с помощью матрицы кодирования M ₁ на частоте 10 ГГц. ( a , b ) 3D-картины рассеяния при TM и TE поляризациях, соответственно. ( c ) 2D-картины рассеяния для TM-поляризации в плоскости x – z . ( d ) 2D-картины рассеяния для TE поляризации в плоскости y – z .

Чтобы преодолеть эффект вращения при наклонном освещении и сохранить диаграммы направленности, такие же, как полученные при нормальном падении, мы предлагаем компенсировать последовательность кодирования при поляризации TM с последовательностью кодирования градиента [00 01 10 11] вдоль y -направление (суперэлементная ячейка 4 × 4), что соответствует однолучевому излучению, направленному в обратном направлении наклонно освещающей плоской волны (- θ _r = -18.2 °). Наложение исходной кодирующей последовательности и компенсационной последовательности может быть выполнено простым вычислением их модуля на 4. На дополнительном рисунке S4a показан шаблон кодирования M ₁ . Согласно принципу пространственной свертки кодирования метаповерхностей ^{, 35,} , мы знаем, что добавление последовательности градиентного кодирования к заданному шаблону кодирования приводит к повороту исходной диаграммы направленности в заданном направлении с высокой точностью. Поскольку угол поворота — θ _r точно противоположен значению угла падения, конечная диаграмма направленности будет отклонена назад в исходное направление с незначительным искажением.Чтобы продемонстрировать эффект метода компенсации и поведение, зависящее от поляризации, мы выполняем численное моделирование реалистичной модели с использованием коммерческого программного обеспечения CST Microwave Studio. Смоделированные диаграммы направленности при наклонном падении с TM и TE поляризацией показаны на рисунках 2a и 2b соответственно. Для поляризации TM (рис. 2a) шаблон кодирования представляет собой последовательность кодирования градиента [00 01 10 11] с размером сверхъединичной ячейки 4 × 4, что приводит к аномальному отражению одного луча из плоскости заболеваемость.Из-за наличия кодирующей последовательности компенсации луч не отклоняется от плоскости x – z . Для поляризации TE (рисунок 2b) шаблон кодирования становится сложением (модуль на 4) двух последовательностей кодирования градиента [11 11 10 10 01 01 00 00…] и [11 11 11 10 10 10 01 01 01 00 00 00…]. Согласно принципу пространственной свертки ³⁵ , угол аномального отражения должен превышать 90 ° для нормального освещения. Однако для наклонного падения функция вычисления аномального угла рассеяния составной кодирующей последовательности должна быть изменена на

, где θ ₁ и θ ₂ — это углы аномального рассеяния составляющего градиента. -кодирующие последовательности, а θ _i — угол падения.Знак минус θ _i указывает на случай, когда угол падения находится на одной стороне аномального рассеяния. Из уравнения (1) получаем отрицательный угол рассеяния 46,8 °. Это довольно противоречивое явление, поскольку падающая и отраженная волны находятся на одной стороне нормали к поверхности, что приводит к отрицательному отражению.

Для ясных наблюдений мы построим двумерные (2D) диаграммы направленности в плоскостях сечения x – z и y – z для TM и TE поляризаций на рисунках 2c и 2d, соответственно.На рисунке 2c мы видим отражение вне плоскости до угла -38,5 °, что полностью согласуется с теоретическим предсказанием -38,7 °. На рисунке 2d отраженный луч направлен в отрицательном направлении 46,5 °, что опять-таки хорошо согласуется с теоретическим значением 46,8 °. Ясно, что диаграммы направленности при обеих поляризациях расположены в ожидаемых плоскостях, что означает, что предложенный метод компенсации эффективно сохраняет диаграммы направленности неизменными при наклонном падении.Обратите внимание, что в этом случае угол падения 18,2 ° выбран просто потому, что последовательность кодирования компенсации является просто последовательностью кодирования градиента [00 01 10 11] с суперединичной ячейкой 4 × 4. Отметим, что наклонный угол может быть произвольно установленный от 0 ° до 90 °, при условии, что мы найдем правильные последовательности кодирования компенсации. Благодаря принципу пространственной свертки цифрового кодирования ³⁵ последовательность кодирования компенсации, указывающая в произвольном направлении, может быть легко получена путем вычисления модуля двух последовательностей кодирования градиента с разными периодами.

Чтобы охарактеризовать эффективность преобразования метаповерхности анизотропного кодирования при манипулировании пространственной PW, мы определяем эффективность как отношение интенсивности пучка излучения между образцом и идеально проводящей платой того же размера. В этом случае эффективность от наклонного падения до аномального и отрицательного отражения может быть прочитана из рисунков 2c и 2d как 70% и 59% соответственно. Однако эффективность преобразования аномального отражения (или отрицательного отражения) может варьироваться в зависимости от различных определений.Например, кто-то может предпочесть использовать интегрированное значение главного луча, а не наибольшую интенсивность излучения в направлении главного луча. Расчетная эффективность будет другой, поскольку мы используем разные методы расчета и разные диапазоны интегрирования.

Дуплексное преобразование пространственных волн в поверхностные волны при нормальном падении

При правильных последовательностях кодирования метаповерхность анизотропного кодирования может преобразовывать PW в SW. Дополнительный фиг. S4b показывает шаблон кодирования M ₂ , который представляет собой комбинацию двух кодирующих последовательностей [11 00 01 01 10 11], изменяющихся в направлениях x и y .Каждая кодирующая цифра состоит только из одной кодирующей частицы. Чтобы продемонстрировать преобразование PW-SW, мы разработали имитационную модель на рисунке 3a, где метаповерхность кодирования, состоящая из кодирующих частиц 24 × 24, размещена рядом с двумя диэлектрическими платами толщиной 4 мм (F4B ɛ _r = 2,65, δ = 0,002), которые используются для приема преобразованных SW.

Демонстрация независимого управления SW с использованием метаповерхностей с анизотропным кодированием при нормальном падении на частоте 10 ГГц.( a ) Схематическая иллюстрация конфигурации моделирования преобразования пространственной волны в поверхностную. ( b , c ) Распределение электрического поля для схемы кодирования M ₂ при x — и y -поляризациях, соответственно. ( d ) Распределение электрического поля ( E _x ) при освещении с поляризацией x , когда матрица кодирования M ₃ . ( e ) Диаграмма дальней зоны при освещении с поляризацией y , когда матрица кодирования M ₃ .

Сначала мы рассмотрим случай нормального падения, в котором массив дискретных портов устанавливается на 80 мм выше метаповерхности кодирования для генерации нормально падающей волны. На рисунке 3b показано распределение электрического поля ( E _x ) в плоскости x – y на частоте 10 ГГц, когда падающая волна поляризована в направлении x . Хорошо видно, что ПВ преобразуются в УВ TE-моды, распространяющуюся в направлении y на левой диэлектрической плате.Однако, когда падающая волна изменяется на поляризацию y , преобразованная УВ меняет направление своего распространения на ось x , как показано на рисунке 3c. Существенная разница между SW, распространяющимися в направлениях x и y , указывает на превосходную изоляцию двух функций при поляризациях x и y . Фактически, последовательность градиентного кодирования может быть произвольно спроектирована для управления направлениями распространения SW при ортогональных поляризациях.Отметим, что такая метаповерхность с анизотропным кодированием с независимым преобразованием ПВ в ПВ в произвольных направлениях может быть использована как составное устройство для поверхностного светоделения.

Чтобы дополнительно продемонстрировать превосходную изоляцию двойных функций метаповерхности анизотропного кодирования при ортогональных поляризациях, мы приводим другой пример, закодированный с помощью матрицы кодирования M ₃ (шаблон кодирования показан на дополнительном рисунке S4c), в котором кодирование последовательность при y -поляризации равна [00 00 01 01 10 10 11 11…], тогда как кодирующая последовательность при поляризации x остается такой же, как M ₂ . В этом случае нормально падающая ПВ преобразуется в УВ при поляризации x (рис. 3d), но аномально отклоняется до -39 ° в свободном пространстве под поляризацией y (рис. 3e). Хотя кодирующая последовательность при поляризации y- отличается от кодирующей последовательности M ₂ , эта кодирующая метаповерхность (M ₃ ) генерирует почти такое же SW, что и в M ₂ , когда падающая волна составляет x . -поляризованный, как это видно на рисунке 3d.Подробную двухмерную диаграмму направленности см. На дополнительном рисунке S5.

Дуплексное преобразование пространственных волн в поверхностные волны при наклонном падении

Теперь мы рассмотрим общий случай с наклонным падением, как показано на рисунке 4a. Чтобы преобразовать наклонно падающую PW в SW для одной поляризации, перенаправляя ее обратно в свободное пространство для ортогональной поляризации, мы разрабатываем шаблон анизотропного кодирования M ₄ , как показано на дополнительном рисунке S4d.Здесь кодирующая последовательность при поляризации TM остается такой же, как M ₁ , тогда как кодирующая последовательность при поляризации TE модифицируется, чтобы изменяться в направлении y- . Угол падения установлен равным 14,5 ° по отношению к нормали к поверхности. Затем размер суперъединичной ячейки последовательности компенсационного кодирования [00 01 10 11] увеличивается до 5 × 5. Следует отметить, что необходимо компенсировать только последовательность субкодирования с поляризацией TM. Для генерации плоского волнового возбуждения с более плоским волновым фронтом на расстоянии 50 мм над метаповерхностью создается массив дискретных портов 20 × 17 с интервалом 6 мм, как показано на дополнительном рис.S6a. Смоделированная диаграмма направленности при TM поляризации представлена ​​на рисунке 4c, который остается таким же, как и на рисунке 2a, с единственным лучом, направленным в направлении -38,5 ° в плоскости x – z .

Манипуляции как PW, так и SW с использованием метаповерхностей анизотропного кодирования с матрицами кодирования M ₄ и M ₅ при наклонном падении на частоте 10 ГГц. ( a ) Схематическое изображение дуплексных разговоров от пространственных волн к УВ при наклонном падении.( b ) Распределение электрического поля при TE-поляризованном освещении для шаблона кодирования M ₄ . ( c ) Диаграмма излучения в дальней зоне при освещении с TM-поляризацией для диаграммы кодирования M ₄ . ( d , e ) Распределения электрического поля для шаблона кодирования M ₅ при наклонном освещении с TE и TM поляризацией, соответственно.

Для поляризации TE период [00 01 10 11] кодирующей градиент последовательности составляет 24 мм.Мы даем оптимальное условие для преобразования ПВ – УВ при наклонном угле падения θ как

, где Γ — период последовательности градиентного кодирования. Уравнение (2) указывает, что падающий луч может иметь наклонный угол в направлении, противоположном направлению SW, когда период последовательности градиентного кодирования меньше длины волны. Рассматривая это уравнение с другой точки зрения, если наклонное падение наклоняется в сторону направления распространения SW, период последовательности градиентного кодирования соответственно увеличивается.В этом случае наклонно падающая ПВ, наклоненная на 14,5 ° в направлении — y — преобразуется в УВ, распространяющуюся вдоль направления + y -, что можно наблюдать по электрическому полю ( E _x компонент) на верхней поверхности структуры на рисунке 4b, где мы можем видеть, что УВ распространяется в направлении + y -. Такое явление может показаться очень ненормальным, если угол падения еще больше увеличивается, потому что преобразованная УВ неожиданно распространяется в обратном направлении, что приводит к отрицательной УВ.

Производительность преобразования PW – SW дополнительно оценивается при различных углах падения θ . На рисунке 5 представлена ​​амплитуда (компонент E _x ) SW, измеренного в центре диэлектрической платы на частоте 10 ГГц. При нормальном падении ( θ = 0 °) интенсивность УВ остается на низком уровне; он начинает увеличиваться, когда угол падения превышает 6 °, и достигает максимума при 15 °, что соответствует теоретическому предсказанию. Интересно обнаружить, что отличное преобразование ПВ-УВ достигается, когда импульс наклонного падения равен импульсу метаповерхности с градиентным кодированием ( ξ ).Следует отметить, что из-за дискретного массива портов конечного размера результаты моделирования ПВ-СВ при больших углах падения могут быть не такими точными, как результаты моделирования при меньших углах падения. Чтобы гарантировать точность результата моделирования, мы предоставляем только амплитуду SW в основном контексте от 0 ° до 27 °.

Напряженность электрического поля, измеренная в центре диэлектрической платы на частоте 10 ГГц при увеличении угла падения от 0 ° до 27 °. На левой верхней вставке показана схема конфигурации моделирования.На нижней правой вставке показана напряженность электрического поля, измеренная в центре диэлектрической платы в широкополосном режиме под углом падения 15 °. Все графики получены с кодовой комбинацией M ₄ при TE поляризации.

На вставке в правом нижнем углу рисунка 5 показаны широкополосные характеристики преобразованного SW (компонент E _x ) под углом 15 °. Хотя кодирующая метаповерхность предназначена для работы с волнами 10 ГГц, максимальная интенсивность наблюдается на немного большей частоте 10.5 ГГц, что может быть связано со следующими причинами. Во-первых, соответствие импеданса между метаповерхностью кодирования и диэлектрической платой не является равномерным в интересующей полосе пропускания. Во-вторых, оптимальная рабочая частота TE-режима SW специально не рассчитана на 10 ГГц с текущей толщиной диэлектрической платы. В-третьих, как неточные отклики реалистичной структуры, так и неидеальная плоская волна могут способствовать расхождению. В целом, как угол падения, так и частота, полученные в результате полноволнового моделирования, достаточно хорошо согласуются с теоретическими предсказаниями.

Мы продемонстрировали поляризационно-зависимую особенность метаповерхности анизотропного кодирования при преобразовании ПВ в ПВ при нормальном падении с шаблоном кодирования M ₂ . В последнем примере мы оцениваем эффективность предложенного метода компенсации при таких преобразованиях при наклонном освещении. Имитационная модель проиллюстрирована на дополнительном рисунке S6b, на котором наклонно падающие волны TE- и TM-поляризации преобразуются в УВ вдоль направлений + y и — x соответственно.Подкодирующая последовательность при поляризации TE идентична последовательности M ₄ , которая изменяется в направлении y , тогда как последовательность подкодирования при поляризации TM такая же, как M ₂ , которая [11 00 01 01 10 11] изменяется в направлении x . Поскольку падающий луч наклонен на 14,5 ° в направлении — y -, последовательность кодирования компенсации [00 01 10 11] (размер суперъячейки составляет 4 × 4), изменяющаяся в направлении y — добавляется к последовательность подкодирования [11 00 01 01 10 11].Шаблон анизотропного кодирования M ₅ показан на дополнительном рисунке S4e, а моделируемые распределения электрического поля для TE и TM поляризаций представлены на рисунках 4d и 4e соответственно. Мы наблюдали, что преобразованные УВ распространяются в желаемых направлениях, включая отрицательный УВ.

Чтобы подтвердить эффект последовательности кодирования компенсации при смещении названного волнового фронта под наклонным падением, мы намеренно моделируем шаблон кодирования M ₅ без добавления последовательности кодирования компенсации.Дополнительный рисунок S7 показывает смоделированные распределения электрического поля ( E _y компонент) при наклонном падении с TM поляризацией. Мы ясно видим, что SW смещен в направлении — y -направлении, в котором наклоняется угол падения. Сравнивая рисунок 4e с дополнительным рисунком S7, мы заметили, что волновой фронт УВ хорошо восстанавливается и распространяется в направлении — x -; таким образом, проверка эффективности предложенной последовательности компенсационного кодирования в преодолении наклонного падения.

Кто такая косая Севилья? Путь ямайского спринтера к Олимпиаде вымощен неудачами и травмами

Ямайский спринтер Oblique Seville хочет максимально использовать опыт, накопленный им на Олимпийских играх 2020 года в Токио. Многообещающий спортсмен занял известность, войдя в состав мужской эстафеты на 100 м и 4х100 м, но его путь к мировой арене был не чем иным, как трудным.

20-летний сенсационный игрок сравнял свой личный рекорд (10,04), заняв второе место в заплывах своих первых международных соревнований на 100 метров среди взрослых.Впоследствии он показал 10.09 четвертым в полуфинале, пропустив место в финале. Тем не менее, он продемонстрировал огромную смелость ямайским фанатам, чтобы взволновать его будущее.

ПОДРОБНЕЕ

Кто отец Элейн Томпсон-Гера? Отец Sprint Queen говорит, что талант к бегу исходит от него

Кто жена Андре де Грасса? Спринтер Ниа Али выиграла олимпийскую медаль через несколько месяцев после рождения ребенка

Кто такая косая Севилья?

Севилья, который был чемпионом первого класса в беге на 100 метров на чемпионате ISSA / GraceKennedy по легкой атлетике среди мальчиков и девочек в 2019 году в старшей школе Калабара в 2019 году, недавно рассказал ямайскому глинеру, как соревнование с лучшими в мире убедило его в том, что он принадлежит их и что его опыт поможет ему подготовиться к предстоящим чемпионатам.

«Этот опыт показал мне, что я могу хорошо выступить на этом уровне и что я могу добиться большего, чем здесь, когда представится возможность принять участие в другом подобном чемпионате. Я знаю, что, работая, я могу продолжать совершенствоваться и добиваться большего », — сказала Севилья изданию The Gleaner. «Это потрясающее чувство — просто знать, что я один из самых молодых спортсменов, и я соревнуюсь, как это, и иду против больших парней», — добавил он. «Я считаю, что для меня это большое достижение».

Севилья надеется, что он сможет внести свой вклад в возвращение Ямайки к вершине мужского спринта, учитывая, что спортсмены-мужчины страны продолжают бороться на крупных международных чемпионатах. На чемпионате мира 2019 года им не удалось завоевать медаль в спринте. Кроме того, не было ни одного ямайского финалиста в беге на 100 метров среди мужчин в Токио-2020.

«Я только постепенно продвигаюсь в этом виде спорта, но надеюсь, что смогу вернуть Ямайке некоторый успех в (мужских) спринтах», — сказал Севилья. Gleaner.«Я хотел бы сказать, что ценю всю поддержку из дома и очень благодарен всем».

Тренер-ветеран «Севильи» Глен Миллс описал своего протеже как сильного спортсмена и считает, что у юноши впереди блестящее будущее, несмотря на ряд неудач в его тренировках.

«Oblique показал, на что он способен, попав в олимпийскую команду с первой попытки стать взрослой командой на международном уровне», — сказал Миллс Star Sports.«Он очень упорный юноша, и его подготовка к Олимпийским играм довольно хороша, но она не соответствовала поставленным мною целям, но я уверен, что он поедет туда и покажет лучшее выступление в своей жизни, и я Я очень уверен, что что бы ни случилось, у него все будет хорошо », — добавил Миллс.

Стоит отметить, что дорога из Севильи в Токио не была легкой. Несколько проблем, включая стойкую травму пальца ноги, помешали его успеху в этом сезоне.

«Предполагается, что он не закончил свой последний год в старшей школе, поэтому он пришел ко мне довольно молодым, и переход из старшей школы в профессиональные звания обычно является очень тяжелым испытанием, и пока то, что мы смогли сделать, — это разработайте программу, которая даст ему время повзрослеть и развиваться в процессе достижения успеха на высшем уровне », — сказал Миллс.

«Пока, как и во многих случаях, у него было несколько неудач», — пояснил тренер. «В первый же год он получил травму подколенного сухожилия, и она была не очень серьезной, но мы вытащили его из дальнейших соревнований на этот год, чтобы он мог пройти курс реабилитации и так далее», — продолжил он. «Затем из-за пандемии мы потеряли несколько месяцев во время изоляции, на этапе разработки, и это замедлило нас, но в случае с молодым Обликом, я думаю, он очень талантлив и у него такая скорость, которая может с ним справиться. очень высоко по лестнице.«

Универсальный микроскоп наклонной плоскости для крупномасштабной визуализации субклеточной динамики с высоким разрешением

[Примечание редакции: авторы обжаловали первоначальное решение. Ниже следует ответ авторов на первый раунд проверки.]

Рецензент № 1:

В этой рукописи авторы описывают развитие концепции однообъективного светового полотна с наклонной плоскостью.Общая идея состоит в том, чтобы создать двумерный световой лист с таким большим углом в образце, который может выдержать объектив. Световое поле излучения передается объективом и другой оптикой в ​​место на пути излучения, где плоскость освещения / излучения может быть отображена линзой с высокой числовой апертурой, наклоненной к оптической оси. Это позволяет формировать на детекторе плоскость без наклона. Как описано во введении к статье, представленная здесь работа является развитием этой концепции.В более ранних конструкциях использовались объективы с более низкой числовой апертурой, чтобы «развернуть» изображение, и несколько ухудшались характеристики, так как не улавливался весь свет под самыми большими углами. В этой конструкции свет не теряется из-за компромиссов в NA. Это достигается за счет использования специально разработанного объектива, который по сути представляет собой иммерсионную стеклянную линзу, улучшающую числовую апертуру за счет более высокого показателя преломления.

Возможность использования стандартных клеточных препаратов, покровных стекол и оптики делает концепцию наклонной плоскости чрезвычайно практичной и действенной.Описанный здесь прогресс является постепенным, но берет концепцию от некоторого компромисса NA к компромиссу без компромисса NA, поэтому непонятно, почему установка с названием плоскости не будет использовать этот подход. Поэтому я думаю, что существует достаточное потенциальное влияние для публикации в eLife.

Учитывая, что влияние этой работы в значительной степени обусловлено ее способностью для большего числа исследователей создавать и использовать световые приборы, авторам следует предоставить более практическую информацию по настройке и юстировке. Например, изображение в дополнительной информации о фактической реализации, основное руководство по выравниванию и вспомогательные оптические / механические части.Или, как минимум, объясните, как они получат это в руки пользователей / разработчиков.

Мы хотели бы поблагодарить рецензента за добрые слова, и мы рады, что они осознают силу этого подхода и верят, что наш метод имеет достаточное влияние для публикации в eLife . Мы также согласны с тем, что предоставление практической информации о настройке и юстировке микроскопа было бы полезно. Таким образом, мы теперь предоставляем базовое руководство по настройке в Приложении 4. Кроме того, мы постарались сделать раздел «Материалы и методы» как можно более исчерпывающим, одновременно указывая потенциально заинтересованным читателям на онлайн-источники информации, которые включают полные списки деталей.

Расположение:

В Приложении 4 мы приводим раздел с советами и приемами по юстировке микроскопа.

Мы также работаем на общественных началах с Applied Scientific Instrumentation, чтобы они могли предоставить под ключ оптические компоненты для сборки микроскопа.

В материалах и методах «Установка лазерного сканирующего микроскопа», втором абзаце, последнем предложении, мы теперь указываем лицам на полный список деталей, предоставленный Millett-Sikking et al.

Мы работаем над размещением CAD-рендеринга микроскопа в Интернете, но эта работа еще не завершена.Тем не менее, если рецензент сочтет это критическим, мы заверяем вас, что мы завершим это до публикации рукописи.

Рецензент № 2:

В этой рукописи Фиолка и его сотрудники пытаются улучшить пространственное разрешение современных реализаций микроскопии с освещением в наклонной плоскости (OPM) и применить свою технику для изображения субклеточной динамики в образцах отдельных клеток. Название рукописи вызвало у меня энтузиазм по поводу того, что авторы достигли технического прорыва в области световой флуоресцентной микроскопии (LSFM), но, к моему ужасу, мой энтузиазм сильно угас после внимательного прочтения их рукописи.Мало того, что авторам не удалось убедить меня в том, что они значительно улучшились по сравнению с ультрасовременным OPM, их данные и анализ не подтверждают их центральное требование о разрешении «в масштабе 200 нм». Здесь мало чего нового в световой микроскопии, и авторы, похоже, сознательно или случайно проигнорировали большой объем литературы, демонстрирующей реализации LSFM с более высокой эффективностью сбора и разрешением, чем то, что они утверждают здесь. Биологическое понимание в лучшем случае скудно, эксперименты представлены как «разовые» без какой-либо статистической строгости или попытки воспроизводимости.eLife просит нас оценивать рукописи, которые соответствуют «высочайшим научным стандартам и важны во всех областях жизни и биомедицинских наук», и эта статья не соответствует этой планке.

Мы ценим тщательный анализ рукописи рецензентом, а также их откровенную критику.

: мы существенно усилили наши измерения разрешения, и теперь они включают анализ декорреляции и анализ корреляции кольца Фурье как для гранул, так и для биологических данных до и после деконволюции.Мы также представляем необработанные данные и данные без деконволюции как для гранул, так и для клеток. Эти измерения еще раз подтверждают, что наш микроскоп обеспечивает разрешение, такое же или лучшее, чем у решеточной световой микроскопии для необработанных и неразвернутых данных (см. 10.1364 / OE.400164, 10.1038 / nature22369, 10.1364 / BOE.11.000008). Кроме того, теперь мы более четко показываем, что этот уровень разрешения может поддерживаться в большом поле зрения.

: Мы не намеревались «умышленно игнорировать» световые люминесцентные микроскопы с одним объективом, основанные на микрозеркалах, кантилеверах или «возбуждении под наклоном с боковой интерференцией», и мы исправили эту ошибку, обсудив эти методы во введении и сравнив наши исполнение им на протяжении всей рукописи.Из нашего анализа ясно, что многие из этих методов не могут конкурировать с полем зрения, возможностями объемной визуализации, разрешением, скоростью визуализации и практическим удобством использования, которые мы демонстрируем с помощью нашего метода.

Биология: Следует признать, что многие из биологических экспериментов, представленных в нашей рукописи, действительно являются «разовыми». Тем не менее, мы всего лишь просим, ​​чтобы рецензент придерживался того же стандарта, что и все другие разработки в области микроскопии, в том числе опубликованные в eLife (10.7554/ eLife .14472, 10.7554 / eLife .32671, 10.7554 / eLife .40805, 10.7554 / eLife .45919, 10.7554 / eLife .46249). Мы считаем несправедливым оговорить, что нам необходимо решить биологическую загадку, улучшив поле зрения в 3,7 раза и согласовав разрешение решетчатой ​​световой микроскопии, метода, который является чрезвычайно сложным и несовместимым с некоторыми из полученных образцов. здесь. Теперь мы более систематически проанализировали стимуляцию PA-Rac1 и можем показать значительное увеличение скорости и продолжительности выпячивания по сравнению с контрольными клетками.

Статистическая строгость: это утверждение явно неверно, поскольку мы сообщаем количественные показатели диффузии цитозольных индикаторов, динамики выпячивания при оптической стимуляции Rac1 и оцениваем функцию распределения точек для большого количества шариков. Важно отметить, что каждое измерение сопровождается стандартными отклонениями или 95% доверительными интервалами. Что касается статистической надежности остальных биологических наблюдений, мы согласны с Yu et al. (10.7554 / eLife .46249), когда они заявляют, что «целью данной статьи была демонстрация технологии, а не проверка гипотезы, [поэтому] мы не определяли заранее какие-либо размеры выборки для этого исследования».

Научные стандарты: Мы не только выполнили научные стандарты, обычно принятые в оптической микроскопии, но и превзошли их, скрупулезно предоставляя подробную информацию о сборе, обработке и анализе наших данных, а также делая общедоступными все данные и программное обеспечение. Исторически сложилось так, что нас наказывали за то, что мы не выполняли деконволюцию наших данных, а также за деконволюцию наших данных.В отличие от многих других рукописей, мы четко указываем разрешение наших необработанных данных и ограничиваем количество итераций Ричардсона-Люси, чтобы избежать вводящих в заблуждение результатов. В самом деле, мы ограничиваем повышение разрешения коэффициентом 2≈1,41, что обычно принимается многими специалистами в области сверхвысокого разрешения как теоретически приемлемое. Напротив, публикации, использующие решеточную световую микроскопию, регулярно деконволюционируют свои данные до тех пор, пока не добьются увеличения разрешения до 1,9 раза в осевом разрешении и с одним заметным исключением (10.1038 / nature22369) не раскрывают исходные значения разрешения (10.1364 / OE.400164., 10.1364 / BOE.11.000008).

Значение во всех областях жизни и биомедицинских наук: мы представили поистине универсальный микроскоп, который уникальным образом обеспечивает разрешение, поле зрения, скорость, субклеточную оптогенетику и возможность получать изображения невероятно разнообразной коллекции образцов, от отдельных клеток до целые ткани. Мы вежливо не согласны с вашим диагнозом, что он важен не для всех областей жизни и биомедицинских наук.

1) Получение изображений LSFM с одним объективом с высокой числовой апертурой не является чем-то новым, и опубликованные работы уже демонстрируют получение изображений с более высокой числовой апертурой с лучшей эффективностью сбора и разрешением, чем то, что сообщается здесь. Существует несколько работ, в которых достигается LSFM с линзами с высокой числовой апертурой и числовой апертурой> 1,1. Самый ранний, который мне удалось найти в моем обзоре литературы, — это Gebhardt et al., Опубликованный в 2013 году. Здесь отражающая поверхность в сочетании с целевыми значениями NA 1,35 и 1,40 NA использовалась для изучения связывания одиночных молекул фактора транскрипции в живых клетках млекопитающих.

Это классический документ из лаборатории Сунни Се, который представляет собой световой лист с диаскопического направления с водным иммерсионным объективом и отражающим кантилевером. Тем не менее, помещая образец в контакт с иммерсионным объективом и кантилевером, он больше не будет стерильным. Кроме того, образец должен находиться в непосредственной близости от наконечника кантилевера, что технически сложно и ограничивает поле зрения примерно 1/200 ^или того, что мы сообщаем для нашего OPM.Кроме того, световой лист не может достичь дна ячеек, так как покровное стекло может аберрировать его. Правильное использование микроскопа на основе АСМ также требует повторной калибровки для каждой ошибки изображения (см. Их методы). Возможно, наиболее важно то, что этот метод несовместим со многими образцами, которые мы визуализируем с помощью нашего OPM, включая микрофлюидные, тканевые срезы, нейроны и т. Д. Таким образом, хотя мы согласны с автором, что это демонстрация одиночного изображения с высокой числовой апертурой. объективный световой лист, ему не хватает общего удобства использования и производительности (поле зрения, объемной скорости визуализации), которые мы демонстрируем.Но сейчас мы включаем это в нашу рукопись.

Эта концепция была усовершенствована и упрощена в использовании в 2015 и 2016 годах Галландом и др. и Meddens et al., которые использовали отражающие микрофлюидные чипы для выполнения визуализации отдельных молекул различных образцов клеток и эмбрионов с высокой степенью обнаружения NA. Медденс использовал линзу с числовой апертурой 1,2, а Галланд — линзу с числовой апертурой 1,3, а Галланд особенно примечателен тем, что, слегка приподняв образец, можно получить изображение всего клеточного образца без клиппирования (в отличие от Гебхардта).Хотя ни Meddens, ни Galland не использовали масляный объектив 1,35 NA, это, по-видимому, тривиальная замена в их системе, и даже с их объективами объектива, о которых сообщают, я подозреваю, что поперечное пространственное разрешение улучшилось по сравнению с этой работой (подробнее об этом ниже). В частности, при чтении Галланда я был поражен концептуальным сходством и целями, изложенными в этой и этой рукописи: «Конфигурация soSPIM обеспечивает широкую модульность. Фазовое изображение, дифференциальный интерференционный контраст, формирование изображений с широким полем, высоким и сверхвысоким разрешением можно выполнять на одном микроскопе.Переключение оптического увеличения не требует перенастройки. Требование идеального механического совмещения двух объективов, используемых в традиционных SPIM, устраняется за счет использования одного объектива в сочетании с программно-управляемым выравниванием светового листа по оси зеркала. Долговременная стабильность повышается за счет использования одного объектива и возможности реализовать систему идеальной фокусировки, встроенную в инвертированные микроскопы ».

Galland, кажется, достигает многих из заявленных целей этой техники.

Galland et al. используйте сложный микрофлюидный метод со встроенными микрозеркалами для освещения образца световой пластиной. Хотя мы согласны с тем, что смена объектива в этой системе тривиальна, фотолитография, последовательное анизотропное и сухое травление кремния и распыление золотых поверхностей для создания микрозеркала — нет. Кроме того, такая конструкция требует, чтобы образец помещался в микрополость, что опять же ограничивает типы образцов, которые могут быть отображены.Даже для агрегатов единичных клеток Galland et al. Пришлось собирать несколько изображений на плоскость изображения с расфокусированным на 20 микрон световым лучом с помощью электропонастраиваемой линзы, а затем сшивать изображения вместе. Точно так же нельзя легко отобразить дно ячейки, так как световой лист будет искажен. Предоставляется очень мало информации о том, как они выполняли или анализировали свое разрешение, и приводится одно значение (565 нм) для ядерной пластинки. Хотя это может быть похоже на наше осевое разрешение при увеличении NA возбуждения, недостаточно информации для правильной оценки, так как не предоставляется статистика.Для образцов размером более 28 микрон они должны существенно уменьшить освещенность NA. Таким образом, наш OPM гораздо более удобен для пользователя и способен отображать гораздо более разнообразные образцы.

Meddens et al. также используют сложный микрофлюидный метод со встроенным микрозеркалом, но их система освещения не имеет настраиваемой линзы. Кроме того, вместо того, чтобы иметь микрополости, Meddens et al. перетекают ячейки в микрожидкостный чип, что требует, чтобы образец преимущественно оседал в области, примыкающей к зеркалу.Также не предоставлено никакой информации об их разрешении в отсутствие изображения STORM. Таким образом, этот метод страдает многими из тех же недостатков, что и Galland et al. что касается разрешения, возможности снимать различные образцы, поля зрения, скорости и т. д. Действительно, из их изображений ясно, что наш метод OPM обеспечивает превосходные результаты визуализации.

И еще есть микроскопия LITE, опубликованная в JCB в 2018 году. Здесь используется наклонный световой лист (2,4 градуса по отношению к горизонтали) в сочетании с оптикой с высокой числовой апертурой, вплоть до числовой апертуры 1.49. Эта последняя NA обеспечивает получение изображений с более высоким разрешением, чем показанное здесь, что подтверждается изображениями шариков с FWHM <250 нм, до деконволюции.

Как позже отметили обозреватели, использование масляной иммерсионной линзы с высокой числовой апертурой приводит к значительным сферическим аберрациям, что обязательно приводит к зависящему от глубины латеральному и осевому разрешению, а также к снижению чувствительности (из-за пониженного коэффициента Штреля). К счастью, хотя изменение объектива в такой системе тривиально, нужно спросить, почему они вообще не использовали иммерсионный объектив с водой или силиконом.К сожалению, это означает, что они могут конкурировать с нашей технологией только на стыке стекла. Как только они проникают в образец на несколько микрон, его характеристики заметно ухудшаются. Кроме того, чтобы покрыть поле зрения 150 микрон, они используют световой лист толщиной 4,3 микрона. Таким образом, их оптическое сечение также будет довольно плохим из-за большого количества нефокусного освещения и размытия изображения. По сути, это «широкое поле» со стороны. Для лучей освещения с более высокой числовой апертурой используемая фотомаска с четырьмя щелями приводит к периодической модуляции интенсивности вдоль оси распространения луча освещения, что делает ее неколичественной.Несмотря на то, что LITE довольно удобен, он требует специальных камер для визуализации и поэтому несовместим с разнообразным набором образцов, которые мы визуализировали (например, микрофлюидные, 96-луночные планшеты). В конечном счете, LITE в принципе способен отображать поле зрения такого же размера, как и мы, но с полной потерей возможности оптического сечения. Кроме того, ему не хватает скорости визуализации и универсальности, которые делают нашу систему мощной и действительно конкурентоспособной с точки зрения разрешения только в области, прилегающей к покровному стеклу.

Как и метод OPM, описанный в этой рукописи, все эти методы имеют свои недостатки — первые три требуют добавления зеркальных поверхностей для изгиба светового листа, а LITE, вероятно, страдает от расфокусированного освещения по полю зрения. и сферическая аберрация при использовании линзы 1,49 NA. Второй недостаток заключается в том, что ни один из этих методов не может легко достичь скорости методов, основанных на OPM.

Спасибо, полностью согласны.Мы обнаружили, что добавление зеркальной поверхности рядом с образцом резко ограничивает универсальность микроскопа и делает рутинное изготовление зеркальной поверхности или работу микроскопа довольно технически сложным. Мы согласны с тем, что эти методы необходимо обсудить, а их сильные и слабые стороны должны быть более подробно описаны.

Тем не менее, значительным преимуществом всех этих «настоящих» однообъективных LSFM над работой авторов является доступ к полной числовой числовой апертуре обнаруживающей линзы без внутренних потерь, возникающих при использовании трех обнаруживающих объективов (71% световых потерь это огромная цена за систему, которая не обеспечивает полную числовую апертуру первичного объектива).Биолог, желающий получить максимальный сигнал и разрешение из своих тусклых образцов (например, как это часто делают одиночные молекулы или эндогенно меченые конструкции CRISPR), вполне может воспользоваться преимуществами этих опубликованных методов, несмотря на их недостатки.

Эффективность сбора микроскопов сильно различается, и о ней редко сообщают. Например, эффективность сбора конфокального микроскопа одной молекулы может составлять всего ~ 3% (см. 10.1529 / biophysj.108.134346). Тем не менее, мы согласны с тем, что каждый жанр микроскопов занимает свою нишу. Если биологу нужен каждый фотон, мы бы порекомендовали микроскоп TIRF (и, возможно, HiLO или режим скользящего падения), потому что он сочетает в себе оптику с высокой числовой апертурой, 100% рабочий цикл освещения, оптическое сечение и обнаружение без аберраций. К сожалению, TIRF и HiLO не очень полезны для получения объемных изображений. Тем не менее, мы также не рекомендуем использовать изображения с сильно аберрированной PSF (например, LITE), так как это обязательно снизит их чувствительность.

Возможно, наиболее важным является то, что мы ясно продемонстрировали, что, несмотря на наши потери, мы можем получать изображения самых разных образцов с незначительным фотообесцвечиванием или фототоксичностью. Хотя мы не представляем данные, мы также выполнили визуализацию единичных молекул живых клеток генетически кодируемых флуоресцентных белков с помощью этого микроскопа. Эта чувствительность одной молекулы согласуется с бумагой eSPIM, а также с работой Сян Чжана (в которой на пути обнаружения используется поляризационный светоделитель, который автоматически отбрасывает 50% обнаруженного света без учета других потерь, 10.1038 / s41592-019-0510-z). Таким образом, мы считаем потери управляемыми, и мы также работаем над их сокращением (например, сокращение количества релейных линз, например, с помощью безлинзовых оптических методов сканирования).

Таким образом, почему ни одна из этих предшествующих работ не обсуждается в рукописи? Самое милосердное объяснение состоит в том, что авторы этой работы не знают об этом, но меня беспокоит, что в своих попытках «продать» свою нынешнюю технику авторы намеренно проигнорировали предыдущие работы.Интеллектуально честное сравнение их метода по сравнению с этими другими методами с более высокой числовой апертурой улучшило бы эту работу — в частности, утверждение, что они достигают «наивысшего латерального разрешения в световой микроскопии», казалось бы совершенно ложным, основываясь на этих предшествующих методах работы LSFM. при более высоком NA.

Как упоминалось ранее, теперь мы обсуждаем эту литературу в рукописи. Мы не намеренно игнорировали эти статьи, чтобы «продать» нашу рукопись. Предполагать, что мы проигнорируем часть литературы, пытаясь продвинуть нашу собственную науку за счет наших коллег, оскорбительно.Напротив, это была искренняя ошибка суждения. Когда мы писали эту рукопись, мы были сосредоточены на решеточной световой микроскопии, которая многими воспринимается как доминирующий и самый совершенный световой микроскоп для получения изображений с высоким разрешением. Хотя рецензент прав в том, что микроскопы с одним объективом и линзами с высокой числовой апертурой обладают потенциалом превосходить разрешающую способность решетчатого светового прибора, решетка гораздо более универсальна в диапазоне исследуемых образцов. Таким образом, мы были слишком узко сфокусированы на решеточной световой микроскопии как главном конкуренте.

Кроме того, мы допустили семантическую ошибку, назвав наш микроскоп для наклонной плоскости световым микроскопом с одним объективом. Тем не менее, мы не считаем эти методы конкурентоспособными с точки зрения технических характеристик прибора (опять же, разнообразия образцов, скорости, поля зрения, оптогенетики…) по сравнению с нашим микроскопом для наклонной плоскости. Мы согласны с тем, что срок наивысшего разрешения на данный момент не оправдан, и соответственно уменьшили количество претензий по разрешению.

2) Заявления о разрешении не подтверждаются данными и не показывают значительного прогресса по сравнению с предыдущей работой.

a) Авторы заявляют о «разрешении по горизонтали в масштабе 200 нм». Их единственным доказательством этого утверждения, по-видимому, являются изображения бусин размером 100 нм, которые они деконволюционировали с помощью алгоритма Ричардсона-Люси. Использование RL на бусинах в качестве метрики исключительного разрешения в лучшем случае наивно, а в худшем — вводит в заблуждение и неверно. Известно, что RL превращает шарики в точки, то есть независимо от физических ограничений оптической системы можно требовать произвольно хорошего разрешения, если выполнить чрезмерную деконволюцию. Как определялось количество итераций и почему не показаны кривые сходимости? Цифры, представленные авторами, вызывают и другие опасения —

.

Теперь мы обеспечиваем ортогональные измерения разрешающей способности прибора, включая анализ декорреляции и анализ корреляции кольца Фурье, и они в значительной степени согласуются с предыдущими измерениями.Важно отметить, что мы сообщаем эти значения для необработанных и деконволюционных объектов, включая бусинки и внутриклеточные мишени. Тем не менее, мы также хотели бы заявить, что большое количество статей по микроскопии сообщают о значениях разрешения RL после деконволюции (например, Lattice, iSIM, ISM, diSPIM,…).

RL: Хотя мы согласны с тем, что деконволюция RL может привести к нереалистичным значениям разрешения для точечных источников, мы четко заявляем в рукописи, что выполняем минимальное количество необходимых итераций (всегда меньше 20) для достижения 2≈1.41 увеличение разрешения, которое считается приемлемым в области сверхвысокого разрешения в зависимости от обстоятельств (т.е. iSIM, ISM и другие методы конфокального переназначения фотонов требуют двукратного улучшения разрешения, где улучшение в два раза физически происходит из-за маленьких точечных отверстий, а другое 2 происходит от итеративной деконволюции. Если бы их разрешение с помощью итеративной деконволюции было нелегитимным, это бы, по существу, исключило бы их из поля сверхразрешения). И коэффициент усиления 1,41 значительно меньше, чем у других в этой области, включая ~ 1.9 улучшений осевого разрешения в решетчатой ​​световой микроскопии. Кроме того, мы выполнили анализ сходимости, но не представили данные в этой рукописи, поскольку они не столь четкие, как мы надеялись (см. Изображение ответа автора 1, осевое разрешение начало выравниваться после 15 итераций, но латеральное разрешение все еще уменьшалось). Таким образом, мы использовали эмпирический квадратный корень из двух критериев, что нередко в области микроскопии. Но, что важно, мы также предоставляем необработанные данные, чтобы читатель мог четко судить, что происходит от необработанной производительности, а сколько от деконволюции.

Однако мы с пониманием относимся к проблемам с деконволюцией, и мы сократили наши требования на основе деконволюционных значений, оцененных с помощью FRC и анализа декорреляции изображений. Теперь мы акцентируем внимание на характеристиках по всему полю зрения, которое, на наш взгляд, впечатляюще однородно. Это более ценное преимущество нашего микроскопа, чем увеличение разрешения в диапазоне десятков нм.

б) Авторы разворачивают свои бусинки до тех пор, пока они не достигнут значения 189 +/- 6 нм. Частота отсечки для линз, которые они используют, при условии света 500 нм, составляет λ / (2 * NA) = 500 нм / (2 * 1,35) = 185 нм. На первый взгляд, деконволюционные числа предполагают, в лучшем случае, что авторы достигают числовой оценки, очень близкой к 1,35. Действительно, количество, которое они сообщают, заставляет меня задаться вопросом, просто ли они деконволюционировали свои данные, пока не приблизились к этому теоретическому значению. К сожалению, их собственные необработанные измерения говорят об обратном, поскольку для тех же гранул в режиме широкого поля (без обнаружения OPM) они сообщают о ~ 240 нм на полуширине.Предполагая, что в этой основной линзе нет дополнительных аберраций, а ~ 240 нм соответствует полной числовой апертуре 1,35, в режиме OPM авторы относительно далеки от достижения характеристик, ограниченных дифракцией — они сообщают о боковых значениях FWHM 284 x 328 нм в поперечном направлении. Конфигурация OPM. Учитывая, что разрешение масштабируется с числовой апертурой, эти числа предполагают (в лучшем случае) числовую апертуру 1,35 (240/284) = 1,14 в направлении, перпендикулярном сканированию, и числовую апертуру 1,35 (240/328) = 0,99 в направлении вдоль изображения. сканирование. Комбинация, похоже, не лучше (или незначительно), чем то, что достигается в решеточной световой микроскопии с 1.1 линза NA.

Хорошо известно, что дифракционный предел Аббе является оптимистической оценкой разрешения, и реальные системы визуализации с высокой числовой апертурой достигают разрешения на ~ 20% меньше из-за многих факторов (коэффициент Штреля <1, затухание маргинальных лучей, функция передачи модуляции, так далее.). Таким образом, мы не согласны с оценками эффективного NA, основанными исключительно на достигнутом разрешении. Если мы аналитически вычислим используемый нами полуугол раскрытия, эффективная числовая апертура для обнаружения будет равна 1.28 (Приложение 3). Мы согласны с тем, что наши измерения хуже в формате микроскопа наклонной плоскости. Мы заметили, что если мы наклоним тракт третичного изображения до нуля, разрешение необработанного изображения в горизонтальной плоскости будет равномерно ~ 270 нм, что больше соответствует расчетной числовой апертуре. Это после прохождения большого количества линз, которые подтверждают правильность базовой оптической конфигурации и юстировки. Тем не менее, это также показывает, что наклон третичной системы формирования изображения вызывает некоторую потерю остаточного разрешения, и оговаривает, что более низкие углы наклона могут быть более предпочтительными для достижения наивысшего разрешения.Мы обсудим эти компромиссы более подробно в Приложении 2.

Однако мы согласны с утверждением, что практическое разрешение, которого мы достигаем, не является драматическим: анализ на основе Фурье показывает наше латеральное разрешение на уровне 220 ± 23 нм (FRC) и 251 ± 3 нм (декорреляция изображения) для деконволюционных биологических данных, решетчатого света. Листовая микроскопия сообщает о значении поперечного разрешения 250 нм. Тем не менее, тот факт, что можно получить аналогичную или даже лучшую производительность с одной основной линзой, что обеспечивает большую гибкость при установке образца, является важным и замечательным открытием, которое позволяет нам снимать гораздо более разнообразный набор образцов.Наконец, мы замечаем, что, несмотря на наши усилия по разблокированию еще более высокого разрешения в OPM, одинаково выгодно увеличивать поле обзора и однородность разрешения, поскольку это позволяет увеличить пропускную способность изображения. Мы можем покрыть 180×180 микрон с довольно равномерным разрешением, что после пересмотра будет более ценным, чем споры о приросте разрешения +/- 10 нм. Таким образом, мы снизили акцент на некоторых наших требованиях к резолюции и переместили некоторое внимание в сторону поля зрения. Примечательно, что в решеточной световой микроскопии используется детекторная линза, которая не корректируется для видимого диапазона, и не используется надлежащая трубчатая линза, что ограничивает ее полезное поле зрения.

c) Авторы утверждают, что OPM занимает уникальную нишу среди LSFM благодаря своей способности легко интегрироваться в существующие рабочие процессы оптической микроскопии. Я с пониманием отношусь к этому аргументу, но не уверен, что описанная здесь методика является концептуально новой или даже выгодной по сравнению с предыдущим современным уровнем техники в этой области: Янгом и др. 5. Как правильно указывают авторы, концептуальный прогресс, реализованный Янгом, заключается в том, что вставка куска материала с высоким показателем преломления между вторичными и третичными линзами обеспечивает лучшую производительность, чем предыдущие OPM.Использование индивидуальной цели вместо неудобной конструкции покровное стекло / вода, используемой в Yang, определенно является шагом в правильном направлении к тому, чтобы сделать метод более практичным и коммерчески жизнеспособным, но не является концептуальным достижением. Вдобавок к этому Ян сообщает о значениях FWHM на основе гранул до деконволюции: 316 ± 8 нм, 339 ± 18 нм в латеральном направлении и 596 ± 32 нм в осевом направлении. Поперечные значения примерно на 10% хуже, чем указанные здесь, что достаточно близко, чтобы мне было очень трудно поверить в то, что работа авторов представляет собой заметный прогресс по сравнению с предыдущей работой Янга и др.то есть небольшое улучшение, о котором они сообщают в значениях FWHM до деконволюции, вряд ли будет иметь какое-либо качественное значение для типа данных / понимания, полученного в отношении этой ранее опубликованной статьи, а также не оправдывает количественный скачок от «масштаба 300 нм» до «200 нм». шкала». Более того, осевое значение FWHM, указанное в Yang, на ~ 25% лучше, чем указанное здесь число 823 ± 31 нм. Взятые вместе, эти сравнения предполагают, что эта работа представляет собой поворот в пространстве параметров, а не прогресс.

Мы хорошо знакомы с eSPIM (Бинь Ян также является соавтором этой рукописи), и мы считаем, что наша рукопись является большим достижением в том, чтобы сделать дизайн eSPIM рутинно полезным для гораздо большего количества образцов. Действительно, наше поле зрения в 3,7 раза больше, чем у eSPIM, благодаря чему система превращается из специализированной системы визуализации отдельных клеток в систему, которая может обрабатывать нейроны, эмбрионы и даже ткани. Мы также представляем первый оптогенетический модуль, который обеспечивает уровень контроля, необходимый для стимуляции клеток произвольным 2D-паттерном синхронно с объемной визуализацией.Хотя наше разрешение схоже, наш путь обнаружения намного более апохроматичен, а наше выравнивание намного надежнее. Мы также можем получить изображение глубже в образце благодаря большему рабочему расстоянию основного объектива. Теперь мы подробно описываем все преимущества нашей системы и eSPIM в вспомогательной записке 1.

В первоначальной рукописи мы не акцентировали внимание на аксиальном разрешении и использовали довольно низкую настройку числовой апертуры, которая подходила бы для самых разных образцов. Однако для исследования возможных осевых разрешений мы систематически меняли эффективную числовую апертуру возбуждения.Мы можем достичь того же аксиального необработанного разрешения, что и в работе Бин Янга, с использованием гауссова луча, хотя мы отмечаем, что этот режим лучше всего подходит для неглубоких, прикрепленных клеток (применяется как к eSPIM, так и к нашей работе).

d) Пожалуй, наиболее примечательно то, что авторы не пытаются проверить «масштаб 200 нм» ни на одном из своих изображений, например путем эмпирического исследования, могут ли они разделить биологические особенности на таком расстоянии, или с помощью методов на основе Фурье, которые обеспечивают карты разрешения на основе пикселей6,7. Это будет иметь большое значение для выяснения того, действительно ли они достигли разрешения «в масштабе 200 нм» по сравнению счто-то вроде разрешения «в масштабе 250 нм» или даже «в масштабе 300 нм» в биологических образцах. В идеале эти вычисления должны выполняться с деконволюцией и без нее, чтобы эффект деконволюции был четко отделен от «сырых» характеристик визуализации. Говоря о сырой производительности, мне непонятно, какие из представленных данных деконволюционированы, а какие необработанные. Представляют ли авторы где-нибудь в этой статье какие-либо необработанные данные? Этот момент требует уточнения.

В данной области принято считать, что тщательный анализ субдифракционных шариков является лучшим методом оценки характеристик прибора.Оценка биологических целей, для которых не существует достоверной информации, потенциально проблематична. Тем не менее, теперь мы предоставляем анализ на основе Фурье (FRC и анализ декорреляции изображений) разрешения прибора с деконволюцией и без нее на биологическом образце. Мы также теперь предоставляем изображения шариков до и после деконволюции (Рисунок 2), а также недеконволюционное изображение ER и эмбриона Drosophila (Рисунок 3 — дополнение к рисунку 1 и Рисунок 8 — приложение к рисунку 1.). Мы также показываем оптогенетические данные в необработанном виде, включая виды сверху и в разрезе.Мы также четко указываем, какие данные являются необработанными, а какие — в развернутой форме в таблице в дополнительном файле 1.

e) Каков размер пикселя в результате работы системы визуализации и представленных здесь данных? Вызывает беспокойство то, что все данные, за исключением бусинок, по крайней мере, были отображены в вокселях 115 x 115 x 100 нм. Один только Найквист сказал бы, что разрешение по горизонтали в масштабе 200 нм невозможно.

Первые два измерения воксела (115 нм) физически задаются увеличением оптической последовательности.Третье измерение (100 нм) задается размером шага лазерного сканирования. В этой рукописи мы, Найквист, отобрали образцы в соответствии с нашим исходным разрешением. Для деконволюции данные о гранулах и биологические данные, в которых разрешалась количественная оценка, были интерполированы на более мелкую сетку перед деконволюцией. Без повторной выборки максимальное разрешение (т.е. там, где достигается критическая выборка Найквиста) составляет 230 нм. Мы не проводили повторную выборку большинства биологических данных перед деконволюцией, потому что их огромный размер стал бы ограничивающим.Термин «разрешение масштаба 200 нм» был удален из рукописи.

3) Значения осевого разрешения, о которых сообщают авторы, значительно хуже, чем у современных многоракурсных методов LSFM8-11, которые могут достигать почти двукратного увеличения осевого разрешения по сравнению с их (вероятными) чрезмерно оптимистичными деконволютивными значениями 570 нм. Эти ссылки должны быть процитированы, поскольку они устанавливают планку осевого разрешения, а не решетчатую систему световых листов. Говоря об осевом разрешении, почему осевая FWHM не указывается в дополнение к боковым измерениям FWHM на рис. 2 — приложение к рис. 5? Пожалуйста, предоставьте все измерения XYZ перед деконволюцией, чтобы «сырые» значения FWHM были очевидны для заинтересованного читателя.Это поможет избежать путаницы в отношении вероятной чрезмерно агрессивной деконволюции.

Мы не оптимизировали осевое разрешение в первой версии рукописи, а использовали световой лист с низкой числовой апертурой для покрытия большинства образцов. Если мы увеличим числовую апертуру светового листа, мы достигнем необработанного осевого разрешения 587 ± 18 нм, что соответствует eSPIM, и лучшего значения необработанного разрешения, чем когда-либо сообщалось для широко используемого решетчатого светового микроскопа (в наиболее часто используемых режим квадратной решетки).Теперь мы сообщаем об аксиальном необработанном разрешении для различных настроек светового листа. Мы считаем, что эти значения конкурируют с другим основным методом, используемым для изображения таких образцов, представленным в рукописи, — решетчатым световым микроскопом.

На Рисунке 1 представлены необработанные измерения XYZ на FWHM, а также деконволюционные значения. На новом рисунке 2 мы теперь также предоставляем необработанные значения разрешения XYZ по всему полю зрения и дополняем их измерением декорреляции изображения.Кроме того, мы сообщаем об анализе FRC и декорреляции изображения для бокового разрешения до и после деконволюции. Я думаю, что это намного более актуально, чем многие другие рукописи, включая методы Multiview LSFM, которые сообщают только о разрешении после итеративной деконволюции. Мы полагаем, что читатель может получить четкое представление о том, сколько можно получить в исходном разрешении с нашей установкой, и что дает деконволюция. Мы чувствуем, что были открыты и прозрачны в отношении наших значений разрешения, намного больше, чем любая другая публикация в области световых листов, о которой мы знаем.

Хотя методы многовидового изображения действительно обеспечивают отличное осевое разрешение, по крайней мере два объектива должны взаимодействовать с образцом. В этой рукописи явная цель состоит в том, чтобы иметь только одну цель, взаимодействующую с образцом, чтобы обеспечить более широкое применение различных образцов. Вы просто не можете поместить многолуночный планшет или другие громоздкие держатели образцов в миллиметровый объем образца многовидового микроскопа.

Теперь мы прямо упоминаем многоракурсные методы в Обсуждении: «В дополнение к простоте использования OPM, описанный здесь, обеспечивает пространственное разрешение, которое не уступает решетчатой ​​световой микроскопии, хотя и с большим полем обзора и более быстрым волюметрическим анализом. емкость изображения.И в отличие от современных многоракурсных методов LSFM, которые обеспечивают немного лучшее осевое разрешение, требуется только одна перспектива изображения ».

Стоит упомянуть, что эти методы многоракурсного LSFM требуют использования того же алгоритма RL для слияния изображений, что является здесь источником большого беспокойства. Например:

Wu et al. (10.1038 / nbt.2713) — сходится после 30 итераций.

Guo et al. (10.1038 / s41587-020-0560-x) — Новый задний проектор, сходящийся примерно за 10 итераций.

Wu et al. (10.1038 / s41467-017-01250-8) — Геометрия отражающего изображения, укажите от 20 до 100 итераций RL в дополнительном файле 3.

Рецензент № 3:

Авторы сообщают об одном микроскопе со световым листом (SOLS), который обеспечивает беспрецедентную числовую апертуру для визуализации светового листа. В микроскопе используется недавно доступный твердотельный иммерсионный объектив для повторного изображения правильно переданной наклонной плоскости изображения на камеру при кодировании информации с высокой числовой апертурой при меньших углах луча, что позволяет получать их без стерических помех между парой удаленных объективов.Это является естественным развитием eSPIM (Yang et al., 2019), который впервые продемонстрировал использование сжатия лучей в SOLS. Применение этой технологии к нескольким приложениям, которые в противном случае были бы чрезвычайно сложными в контексте светового листа / визуализации в реальном времени, иллюстрируют, что микроскоп может отображать традиционные препараты образцов, в микрожидкостных чипах и с высокой скоростью объемного изображения. Эти приложения представляют собой подходящую демонстрацию технологии и многообещающие пути для дальнейших исследований без предоставления существенных биологических выводов.Учитывая технологическую направленность статьи, я считаю, что статья тем не менее заслуживает публикации в eLife, когда будут решены указанные ниже проблемы. В более общем плане, я считаю, что эта работа и недавние разработки, на которых она основана, будут иметь огромное значение для сообщества специалистов по клеточной биологии в ближайшие годы.

Перед публикацией необходимо рассмотреть следующие основные моменты:

1) Сказав, что это технологически ориентированная статья, по крайней мере, с точки зрения новаторства в подходе, я на самом деле почувствовал, что в этой статье не хватает статьи.Я знаю, что большая часть разработок, связанных с целью твердого погружения, сообщается из источников, не прошедших экспертную оценку (GitHub и т. Д.). Однако, поскольку это первое рецензируемое исследование с использованием этой технологии, более подробное описание системы, тем не менее, представляется оправданным, особенно в отношении оптического моделирования, аберраций / полезного поля обзора (например, сравнения моделирования с наблюдениями) и обсуждения различные компромиссы и т.д.У авторов есть уникальные возможности для предоставления этой информации.

Мы согласны с тем, что более подробное описание твердотельной иммерсионной цели было бы полезно. Мы подробно описали некоторые варианты дизайна и их последствия в Приложениях 1-3. Однако в духе поддержки открытых научных идеалов Эндрю Йорка и Альфреда Миллетт-Сиккинга (которые, по нашему мнению, хорошо согласуются с миссией eLife ), мы согласились позволить им хранить многие из этих деталей на своем GitHub. страницу и процитировать ее как материалы, представленные Zenodo.Дополнительные сложности возникают из-за неразглашения служебной информации (которую не знают даже соответствующие авторы) относительно третичной цели в соответствии с соглашением между Calico, ASI и Special Optics. Тем не менее, теперь мы приводим перечень этих различий в Приложении 1.

2) Авторы включают несколько сравнений с решеточной световой микроскопией, которые могут быть лучше подтверждены соответствующими данными и расширенным обсуждением. Это отмечено в комментариях ниже.Точно так же я считаю, что авторы уникально могут предоставить дополнительную информацию с помощью моделирования и данных, которые, вероятно, уже существуют, например Измерения PSF флуоресцентных шариков (например, Chang et al., 2019). Авторам также было бы полезно сравнить с некоторыми другими отчетами по световой микроскопии высокого разрешения, например, Бесселев пучок (одно / двухфотонное возбуждение, микроскопия световых листов с осевой разверткой).

Рецензент прав в том, что мы уникально приспособлены для предоставления этих данных, но хотел отметить, что наша работа по синтезу полей была выполнена с парой значений NA 0.Объективы 8 / 40X, а не намного более дорогие объективы, использованные в оригинальной рукописи на решетке. Таким образом, сравнение нашей NA 1,35 и NA 0,8 было бы нечестным. Кроме того, проведение такого тщательного анализа — задача не из легких, особенно во время пандемии. Тем не менее, мы твердо уверены, что, предоставляя необработанные и деконволюционные данные для каждой опубликованной нами методики микроскопа, мы оставили читателям более прозрачный способ сравнения оптических характеристик различных микроскопов.Необработанная информация о разрешении полностью отсутствует в оригинальных публикациях по световым листам на решетке, и мы надеемся, что недавней публикации нашей лаборатории (Chang et al., 10.1364 / OE.400164) будет достаточно, чтобы пролить свет на эту тему.

Введение: авторы отмечают, что предыдущие реализации LSFM требовали монтажа либо на небольшом покровном стекле (например, решетчатом световом листе), либо в пробирках с агарозой (более классические системы типа SPIM). Однако авторы не отмечают, что в последнем случае это действительно лучший способ крепления e.грамм. для развития эмбрионов, поскольку мягкая окружающая среда способствует нормальному развитию (например, Kaufmann et al., Development, 2012), тогда как поверхность раздела из твердого стекла — нет. Я понимаю, что эти приложения выходят за рамки того, что представлено здесь, но я все же думаю, что необходимы дальнейшие разъяснения и что желание использовать традиционные препараты является скорее проблемой для клеточных культур и высокопроизводительной визуализации. Тем не менее, авторы должны отметить, что установка покровного стекла может приводить к появлению биологических артефактов в контексте их более ранних исследований с использованием коллагеновых гелей для монтажа с использованием подхода SPIM с большим рабочим расстоянием (Welf et al., Dev. Cell, 2016).

Мы приняли эту рекомендацию.

Результаты: Прокомментируйте, пожалуйста, выбор угла и компромиссы, связанные с наклоном от 0 до 45 градусов.

Приложение 2 теперь обсуждает это. Короче говоря, для наилучшего разрешения и сбора света вам нужно наклонять как можно меньше. Однако чем мельче световой лист, тем он должен быть длиннее и тем толще становится. Кроме того, останется меньше числовой апертуры для формирования светового листа.Разумный критерий, который мы придумали, состоит в том, чтобы потребовать, чтобы вы нашли угол наклона, который оставляет достаточно числовой апертуры для оставшегося светового листа, чтобы можно было создать перетяжку луча, размер которой равен осевой ширине PSF обнаружения. Для нашей системы этот угол наклона оказывается довольно близким к 30 градусам.

Подраздел «Характеристики прибора»: не могли бы вы прокомментировать, как это соотносится с eSPIM (Yang et al., 2019). Поперечное разрешение кажется немного выше, но осевое разрешение кажется ниже (при условии использования гауссова луча для eSPIM).Является ли это результатом более длинного и толстого светового полотна или разницы в том, как он наклонен относительно оси обнаружения? Это удивительно с учетом дополнительных ок. 0,2 Н / Д предоставляется представленной системой.

В исходной заявке мы оценили числовую апертуру светового полотна. Мы добавили камеру, сопряженную с плоскостью зрачка, для лучшей оценки числовой числовой числовой апертуры светового листа. Мы систематически меняли числовую апертуру светового листа и можем соответствовать осевому разрешению, о котором сообщил Бинь Ян.Однако это происходит за счет объемного покрытия, то есть меньший диапазон в z-направлении (перпендикулярно покровному стеклу) может быть покрыт более тонкими световыми листами. Однако это не отличается от работы Янга.

и осевое разрешение 823 нм?

Спасибо, что указали на это.

Заключительный абзац подраздела «Характеристики прибора»: не могли бы вы прокомментировать лечение здесь. Если взять эффективность просто как NA ² , получаем прибл.1.5, 1.9x соответственно. Это без учета небольших потерь числовой апертуры по сравнению с 1,35, обеспечиваемой иммерсионным Si-объективом. Тем не менее, этот анализ приветствуется и обычно занижается при однообъективной световой микроскопии.

Мы рассмотрели этот вопрос более тщательно в Приложении 3. Эффективное числовое значение по консервативным оценкам составляет 1,28. Таким образом, КПД всего на 35% выше, чем у NA 1.1. линза. Это нижняя граница, которая не учитывает немного более высокую числовую апертуру, доступную в направлении, перпендикулярном наклону.

Рис. 2 a) Есть ли причина выбирать другую таблицу поиска цветов для этого изображения?

Эта таблица поиска была выбрана, поскольку она позволяет визуализировать как яркие, так и тусклые структуры. Теперь мы ясно заявляем об этом в легенде рисунка.

Обсуждение второй абзац: Повторяющееся в отношении Введения.

Мы согласны, но введение и обсуждение часто имеют некоторую избыточность.

“… он имеет самую высокую поперечную разрешающую способность (~ 200 нм) в световом листе

микроскопия.Действительно, из-за малой глубины резкости, обеспечиваемой оптической конструкцией, осевая разрешающая способность ». Это разрешение деконволюции. Было бы полезно включить PSF из световых микроскопов и сообщать как исходное, так и деконволютивное разрешение в каждом случае. Предыдущие усилия авторов по полевому синтезу должны дать необходимые данные (Chang et al., 2019).

Теперь мы предоставляем PSF в необработанном и деконволютивном состоянии. Хотя мы согласны с тем, что было бы полезно включить PSF из других микроскопов, как указывалось ранее, что требует значительной работы, для которой в настоящее время нам не хватает времени в лаборатории из-за пандемии COVID.

Что касается контраста и осевого разрешения, которые связаны вместе, решетчатый световой лист предположительно сохраняет тонкий профиль на большем расстоянии, чем чисто гауссовский световой лист. Авторы должны сообщать об используемом поле зрения, отмечая сравнения контрастности и разрешения (и преобладают ли при этом требования к тонкому световому полотну или, скорее, к схеме обнаружения оптики / дистанционной фокусировки). Гауссовский лист должен давать лучший контраст в фокусе, тогда как решетка обменивает некоторый контраст на поле зрения.Однако высокая NA в случае SOLS означает, что световой лист будет толще в талии, чем глубина резкости, и поэтому здесь также теряется контраст. Опять же, у авторов есть уникальные возможности для более строгих сравнений. Как минимум, было бы полезно указать длину и толщину светового листа, полученного при числовом значении 0,2 — 0,3 (указано в материалах и методах), чтобы обеспечить некоторую меру эффективного поля зрения и контраста для решетки и Кейсы SOLS.

При умеренных НУ, используемых для освещения с нашим OPM, гауссовы пучки и квадратная решетка из решетчатой ​​световой микроскопии (наиболее часто используемый вариант) имеют неразличимые длины распространения (с точки зрения FWHM и конфокального параметра) и перетяжки пучка (см. Chang и др., 10.1364 / OE.400164). Таким образом, можно ожидать, что гауссов луч действительно обеспечивает превосходный контраст для данного поля зрения, поскольку он не имеет структур боковых лепестков, которые приводят к расфокусированному освещению.

Теперь мы обеспечиваем измерения длины распространения и числовой апертуры осветительных лучей, использованных на рисунке 2. Как видно при максимальной освещенности NA (0,34), перетяжка луча проявляется в осевом разрешении для шариков, подвешенных в агарозном геле. Здесь в аксиальном разрешении преобладает толщина светового листа. По мере уменьшения NA освещения и увеличения перетяжки пучка, превышающего глубину фокуса, осевое разрешение в конечном итоге приближается к ~ 800 нм.

Что касается требований к мощности лазера и синхронного многоцветного изображения, это в значительной степени является результатом того, как обычно генерируются решетчатые световые полосы.Предыдущие собственные исследования авторов, касающиеся полевого синтеза (на которые следует указать), уменьшили эти проблемы для всех, кто может выбирать, создавать ли систему SOLS или решетчатую световую пленку. Основной остающейся проблемой является отсутствие изоляции между целями и средствами массовой информации и стерическими проблемами.

В связи с возражениями рецензента №2 мы удалили комментарий о мощности лазера. Тем не менее, мы приняли вашу рекомендацию процитировать полевой синтез, а также упомянуть стерильность и изоляцию среды.

Подраздел «Постобработка данных»: Прокомментируйте, пожалуйста, время и вычислительные ресурсы, необходимые для срезания и деконволюции наборов данных. Поскольку система SOLS хорошо подходит для средств визуализации, необходимо учитывать соответствующую пропускную способность.

Используемый нами исследовательский код, безусловно, можно оптимизировать, и мы полагаем, что возможно срезать и деконволютировать данные в реальном времени с помощью графического процессора. Тем не менее, теперь мы предоставляем приблизительное время для стрижки и деконволюции в разделе постобработки данных.

[Примечание редакции: далее следует ответ авторов на второй этап рецензирования.]

Рецензент № 3:

Авторы внесли существенные изменения в рукопись после первого раунда рецензирования. Я остаюсь непоколебимым в своем мнении, что эта работа может быть опубликована в eLife с учетом необходимых улучшений. Я считаю, что внесенные изменения улучшили рукопись.

В частности, оценка PSF системы и разрешающей способности была значительно улучшена за счет включения недеконволюционных PSF, деталей деконволюции и оценки разрешения кольцевой корреляции Фурье.Обсуждение истинных однообъективных систем световых лучей и сравнение с eSPIM помещает описанный метод в контекст, и я считаю, что это помогает сделать его аргументы гораздо больше, чем отвлекает от него. Приложения должны каким-то образом помочь другим в построении такой системы.

Есть еще некоторые изменения, основанные на моих предложениях, которые в идеальных условиях были бы приняты. Однако аргументы автора в пользу того, что он этого не сделал, хорошо аргументированы. В первую очередь меня беспокоило частое сравнение с решетчатой ​​световой микроскопией.Здесь я все еще считаю, что рукопись несколько отсутствует, но я понимаю, что созданная авторами система световых листов на решетке синтеза поля не использует типичную конфигурацию линз объектива, что затрудняет сравнение. Преимущества заявленной системы в любом случае лежат глубже, чем чистые заявления о разрешении, и, учитывая недавнюю публикацию автора (Cheng et al. 10.1364 / OE400164), в которой говорится о сравнении гауссовского и решетчатого световых листов, упущение здесь разумно оправдано.

В общем, рекомендую статью к публикации.

Мы хотели бы поблагодарить рецензента за то, что он еще раз нашел время для тщательной оценки нашей рукописи. Чтобы удовлетворить ваш последний запрос, мы теперь предоставляем PSF, полученные доктором Тэлли Ламбертом из Гарвардской медицинской школы на решетчатом световом микроскопе Бетцига. Как видно на Рисунке 2 — Дополнение 3 к рисунку и количественные измерения в соответствующем подписи к рисунку, две PSF сопоставимы.

Рецензент № 4:

Во-первых, я хочу поблагодарить авторов за их тщательную переработку.Они решили многие из моих проблем, и я чувствую себя лучше по поводу рукописи в целом. Акцент на поле зрения над разрешением, методы оценки разрешения, основанные на Фурье, цитирование предыдущих работ, дополнительные детали, изложенные в приложениях, и более точное упоминание их метода как OPM — все это значительно улучшило работу. Вот мои оставшиеся проблемы / комментарии:

а) Теперь авторы более справедливо описывают преимущества своего метода по сравнению с предыдущими аналогичными микроскопами.Они до сих пор не указывают четко, что я считаю слабыми сторонами их метода, что кажется важным, учитывая обширные сравнения с LLSM и другими системами:

i) относительно низкая чувствительность. В своей переработанной рукописи авторы теперь, кажется, признают, что преимущество в световой эффективности, обеспечиваемое линзой с числовой апертурой 1,35, меньше, чем оптические потери на пути их излучения. В целом, эти потери, по-видимому, означают строго более низкую чувствительность, чем более «традиционный» LLSM с обнаружением 1,1 NA.Пожалуйста, четко обсудите этот момент в основном тексте, а не относите его к Материалам и методам.

Мы переместили это обратно в часть основного текста, посвященную конструкции микроскопа. Теперь текст гласит: «Из-за большого количества оптических элементов паразитные отражения привели к снижению пропускания флуоресценции на 59% и 44% для вариантов микроскопа с лазерным сканированием и предметным сканированием, соответственно, под углом 30 градусов. Передача немного улучшилась (3%), когда оптическая система была установлена ​​под углом 0 градусов.”

ii) Низкая эффективная NA по сравнению с теоретической NA. Я ценю приложение, описывающее расчеты числовой апертуры, но я все еще не уверен, что представленное число является «эффективной числовой апертурой», то есть числовой апертурой эквивалентного широкоугольного объектива с основным объективом, использующим эту числовую апертуру. В частности, меня до сих пор беспокоит очевидная потеря разрешения по сравнению с их широкополосными характеристиками, которые я ранее прокомментировал и повторяю здесь:

«К сожалению, их собственные необработанные измерения говорят об обратном, поскольку для тех же гранул в режиме широкого поля (без обнаружения OPM) они сообщают о ~ 240 нм на полуширине.Предполагая, что в этой основной линзе нет дополнительных аберраций, а ~ 240 нм соответствует полной числовой апертуре 1,35, в режиме OPM авторы относительно далеки от достижения характеристик, ограниченных дифракцией — они сообщают о боковых значениях FWHM 284 x 328 нм в поперечном направлении. Конфигурация OPM. Учитывая, что разрешение масштабируется с числовой апертурой, эти числа предполагают (в лучшем случае) числовую апертуру 1,35 (240/284) = 1,14 в направлении, перпендикулярном сканированию, и числовую апертуру 1,35 (240/328) = 0,99 в направлении вдоль изображения. сканирование. Комбинация, похоже, не лучше (или незначительно), чем то, что достигается в решеточной световой микроскопии с 1.1 линза NA ».

В идеале разрешение нашего микроскопа должно быть идентично разрешению объектива микроскопа при работе в режиме формирования изображений с широким полем. Однако это ожидание кажется нереалистичным, поскольку мы используем цель в таких неидеальных условиях. Действительно, мы получаем изображение выше и ниже номинальной фокальной плоскости первичного объектива и используем физически несовершенную оптику для создания реплики этой флуоресценции выше и ниже номинальной фокальной плоскости вторичного объектива.Как указывалось ранее, настоящие объективы редко достигают полного разрешения, предсказываемого идеальными моделями. Таким образом, следует ожидать некоторой деградации.

Очень разумно предположить, что числовая апертура будет масштабироваться в соответствии с видимым размером субдифракционного объекта, независимо от субоптимального коэффициента Штреля, MTF, оборудования и т. Д. И если числовая апертура первичной линзы фактически меньше 1,35, это, по-видимому, еще более усугубит ситуацию. уменьшить «эффективное» NA, которое достигается в этой рукописи. Этот момент важно рассмотреть должным образом, потому что он имеет значение как для сравнения с другими микроскопами, так и предполагает, что представленные авторами числа деконволюции по-прежнему чрезмерно оптимистичны (например,грамм. если числовая апертура фактически не равна 1,28, физически не представляется возможным достичь разрешения после деконволюции ~ 203 нм, как показано на рисунке 1H). Я бы предложил заменить «эффективную NA» на «теоретическую NA» везде, где упоминается первое, и очень четко указать в рукописи, что все еще есть остаточная потеря разрешения: то есть теоретическая NA не достигается при настройках наклона, используемых в этой статье. . Авторы могли доказать, что я ошибаюсь, предоставив достаточно убедительное измерение «эффективной NA», а не теорию — представление теоретических аргументов никак не убеждает меня в том, что на самом деле они достигают этого значения, которому их собственные измерения, кажется, противоречат.

Мы понимаем озабоченность рецензента и в рукописи использовали термин теоретическая NA. Мы также заявляем в основном тексте, что система работает ближе к ожидаемой числовой апертуре при уменьшении угла наклона третичной системы визуализации, и что есть некоторая остаточная потеря разрешения, когда в третичной системе визуализации вводится значительный наклон. В разделе описания прибора текст теперь гласит: «Следует отметить, что выбор угла освещения сопровождается компромиссом между толщиной светового листа, глубиной изображения, эффективностью обнаружения и разрешением (Приложение 2).Действительно, мы наблюдали постепенную потерю NA и, следовательно, разрешения, когда наша система третичной визуализации была настроена от 0 до 30 градусов ».

б) Что касается деконволюции, мне все еще трудно понять, как разрешение ~ 203 нм возможно с вокселями 115 нм. И снова один Найквист, казалось бы, сделал это число неверным. Аргумент авторов при использовании коэффициента 1,414, по-видимому, сводится к следующему: «это сделали другие люди, поэтому мы тоже должны это сделать». На мой взгляд, это не лучший аргумент, так как приводит к результату, противоречащему здравому смыслу.Авторы в цифровом виде повышают дискретизацию данных шариков перед деконволюцией, но я не вижу, как такой цифровой апсемплинг может эффективно победить Найквиста.

Одна из интерпретаций итеративной деконволюции заключается в том, что она делает изображение более резким, экстраполируя низкочастотную информацию в более высокочастотное пространство, где раньше информации было мало или вообще не было. Заполняя данные нулями, мы, по сути, вводим пустое частотное пространство, в которое процедура итеративной деконволюции может экстраполировать.Важно отметить, что данные FRC поддерживают эту точку зрения. Здесь частотная поддержка, в которой содержится значимая информация, резко обрывается, а итеративная деконволюция расширяет эту область до более высоких значений частоты. Таким образом, не имеет значения, создается ли это пространство, в которое экстраполируется информация о выборке, путем заполнения нулями или более точной пространственной выборкой (которая также создает пустое частотное пространство, хотя и с некоторым белым шумом). Это подтверждается работой доктора Райнера Хайнцманна, которая показывает, что можно получить ~ 1.5-кратное разрешение «вне диапазона» с Ричардсон Люси благодаря предположениям неотрицательности и итерациям в реальном пространстве (DOI: 10.1016 / j.micron_2006.07.009), в зависимости от образца и условий визуализации. Также обратите внимание, что diSPIM по необходимости использует возможность экстраполяции деконволюции RL. Физическое покрытие в обратном пространстве с двух точек зрения оставляет два больших отсутствующих конуса в диагональных направлениях. Вместо того, чтобы физически заполнять эти пустоты информацией путем получения взглядов с других ориентаций, они заполняются деконволюцией RL.Однако, хотя diSPIM никогда не показывал, что эта внеполосная информация действительна, мы показываем здесь в нашей работе доказательства с использованием корреляции кольца Фурье.

В целом, мы думаем, что обсуждение того, что может и чего нельзя делать деконволюция RL, зарезервировано для специализированных журналов и публикаций, таких как журнал Райнера Хайнцмана. Мы упоминаем об этом сейчас в разделе «Материалы и методы».

Авторы в своем опровержении, кажется, предполагают, что представление необработанных значений без деконволюции необычно для многоракурсной LSFM («Я думаю, что это намного более актуально, чем многие другие рукописи, включая методы Multiview LSFM, которые сообщают о разрешении только после итеративной деконволюции») .Я не уверен, о чем они говорят: Wu 2013 (diSPIM), Keller 2015 (IsoView), классика в этой области, четко указывают эти значения в основном тексте.

Приносим извинения за недопонимание. Необработанное разрешение для каждого вида часто указывается в рукописях многоракурсного LSFM, но объединенное разрешение часто указывается только после деконволюции Ричардсона-Люси. Это, вероятно, является результатом того факта, что без деконволюции необходимо 6-8 просмотров для достаточной выборки пространства Фурье (см. DOI: 10.1364 / OE.15.008029). Тем не менее, эти рукописи поучительны:

Wu et al., 2013:

Осевое разрешение (дополнительная таблица 1) — 1,47 мкм в исходном состоянии, 0,8 мкм после извлечения (коэффициент 1,83).

Арифметическая сварка (дополнительная таблица 1) — 0,98 мкм в исходном состоянии, 0,62 мкм после деконволюции (коэффициент 1,58).

Слияние и деконволюция суставов (дополнительная таблица 1) — осевое разрешение 0,33 мкм.

Сбор данных (см. Онлайн-методы) — «В каждом трехмерном стеке 50 или 100 плоскостей xy, разделенных шагом az в 1 микрон из 0.5 микрон »

Повышающая дискретизация (см. Онлайн-методы) — «Просмотр _A подвергается повышающей дискретизации (т.е. грубо дискретизированные аксиальные пиксели были линейно интерполированы для получения изотропного размера вокселя 0,1625 x 0,1625 x 0,1625 мкм ³ ».

Заключение — Wu et al. увеличьте разрешение своих данных с 0,5 микрона или 1 микрона до 0,1625 микрона и получите разрешение 0,33 микрона. Их деконволюция намного агрессивнее нашей.

Chhetri et al. (не Келлер), 2015:

Осевое разрешение (дополнительный рисунок 6) — 3.01, 2,95, 2,63 или 3,34 мкм, в зависимости от оси изображения.

Арифметическое объединение — Не предусмотрено.

Multiview Deconvolution (Дополнительный рисунок 6) — Сообщите о разрешении 410, 420 и 450 нм.

Получение — Сообщается о боковом размере вокселя 0,4 микрона. Осевой размер не указан.

Передискретизация (методы, регистрация многоракурсного изображения IsoView) — «На первом этапе нашей процедуры регистрации мы выполняем грубое выравнивание изображения. После кубической интерполяции для создания вокселей с изотропным размером… »

Заключение — Chhetri et al.увеличивайте их данные и сообщайте о разрешении ~ 400 нм. Также кажется, что их деконволюция намного агрессивнее, чем наша.

Таким образом, мы полагаем, что ваши опасения по поводу выхода за пределы выборки Найквиста также должны быть применены к их результатам деконволюции. Но, как указывалось ранее, это не оспаривается теоретическими работами по итеративной деконволюции.

c) Авторы, похоже, признают в своем опровержении, что они не достигают характеристик, ограниченных дифракцией («мы согласны, что не достигаем характеристик, ограниченных дифракцией»), но я все же нахожу в рукописи несколько мест, где это заявлено или подразумевается .Пожалуйста, обратите внимание на этот момент.

Мы больше не заявляем и не подразумеваем, что достигаем дифракционно ограниченных характеристик по всему тексту, за некоторыми исключениями. В Приложении 1, пункт 2, мы четко заявляем, что поле зрения теоретически ограничено дифракцией (не ограничено дифракцией экспериментально), что является точным. То же самое и с подпунктом 3. В остальной части текста теперь указано «ограничение дифракции, близкое к дифракции», что является точным и подтверждается нашими измерениями волнового фронта (Strehl = 0,97 при 0 градусах и 0.91 под углом 30 градусов, см. Рисунок 1 — дополнение к рисунку 2).

г) Глубина. Что устанавливает эффективный предел глубины этой техники, как показано здесь? 25-30 мкм — это относительно скромно для линзы с рабочим расстоянием 300 мкм, поэтому обсуждение теоретических и практических ограничений было бы полезно для биолога, который ищет практическое решение для своего образца.

Эффективная глубина изображения зависит от двух отдельных факторов. Первый и наиболее интуитивно понятный фактор — это рабочее расстояние основного объектива, которое, как вы утверждаете, составляет 300 микрон.Второй фактор — это расстояние, на котором система удаленной фокусировки функционирует должным образом, что влияет на размер W на рисунке 1. И в линейной, и в наклонной конфигурациях мы достигли ~ 60-80 микрон высококачественной удаленной фокусировки, и это позволил нам недавно изобразить весь хвост рыбки данио. Важно отметить, что можно по-прежнему размещать данные в направлении Z в пределах рабочего расстояния объектива при условии, что образец не имеет значительного несоответствия показателей преломления.Стремясь донести эту тему, мы теперь ясно указываем эти практические ограничения в основном тексте рукописи. В частности, в разделе описания прибора говорится, что «Теоретически максимальная глубина визуализации нашей системы удаленной фокусировки составляет 60 микрон, за пределами которой можно выполнять мозаику в Z-измерении до тех пор, пока не будет достигнуто рабочее расстояние основного объектива (300 микрон. ) ».

e) Авторы неоднократно заявляли, что они достигают разрешения на уровне или лучше, чем LLSM.Пожалуйста, явно укажите соответствующие значения, указанные в LLSM (или измерьте их с помощью LLSM с определением 1.1 NA), где это уместно.

Рукопись оригинальной решетки, а также многие последующие, не предоставляют достаточных доказательств, чтобы поддержать их утверждения о разрешении. Однако есть одно исключение (DOI: 10.1038 / nature22369), в котором четко указано, что их поперечное и осевое разрешение варьируется между 294–370 нм и 649–947 нм, соответственно, в зависимости от длины волны лазерного излучения.Точно так же мы недавно опубликовали рукопись (DOI: 10.1364 / OE.400164), в которой исчерпывающе оценивались свойства световых листов (толщина, конфокальный параметр, разрешение, OTF и т. Д.) Как для решетчатых, так и для гауссовских световых листов. В совокупности эти две рукописи ясно показывают, что мы достигаем разрешения на уровне или выше, чем у LLSM. Тем не менее, теперь мы предоставляем дополнительные доказательства этого в виде PSF, приобретенных на LLSM Тэлли Ламбертом в Гарвардской медицинской школе (система, созданная группой Бетцига).Опять же, эти данные показывают, что мы действительно находимся на уровне или лучше, чем LLSM.

Теперь в тексте говорится: «И для косого угла освещения 30 градусов эти необработанные осевые разрешения аналогичны или лучше, чем осевое разрешение 666 нм, указанное для режима квадратного освещения решетчатой ​​световой микроскопии».

«Для сравнения, исходное латеральное разрешение для решетчатой ​​световой микроскопии для GFP-подобного флуорофора составляет 312 нм…».

f) «И в отличие от современных многоракурсных методов LSFM, которые обеспечивают немного лучшее осевое разрешение, требуется только один объектив и перспектива изображения (Guo et al., 2020; Wu et al., 2013) ». В Wu 2013 достигается осевое разрешение ~ 350 нм, в Wu 2017 — ~ 300 нм, а Guo 2020 увеличивает эффективное аксиальное разрешение LLSM до разрешения ~ 380 нм. Они не «немного лучше», они значительно лучше (действительно, степень улучшения более убедительна, чем то, что показано здесь относительно LLSM). Кроме того, как я думаю, авторы признают в своем опровержении, они не используют единственную цель, а используют 3. Пожалуйста, удалите «немного» для точности и / или переосмыслите это предложение.

Как указывалось ранее, многовидовые световые микроскопы достигают лучшего осевого разрешения, чем наш, только после слияния изображений и деконволюции. Как мы ясно показываем, наше лучшее необработанное осевое разрешение 580 нм значительно лучше, чем исходное осевое разрешение 1,47 мкм, о котором сообщает Wu et al., 2013. И эти рукописи гораздо более агрессивны в своей деконволюции, чем мы.

Но чтобы быть конструктивным, а не бесконечно обсуждать, какой выигрыш в разрешении дает итеративная деконволюция, возможно, давайте обсудим, что физически возможно, до любой деконволюции.Наивысшее осевое необработанное разрешение для светового листа до деконволюции составляет около 380 нм (Dean et al., 2015), наше лучшее разрешение на 200 нм хуже. Дин и др. использовали числовую апертуру ~ 0,8 для генерации световых слоев, наша — менее половины этого значения. Мы можем согласиться с тем, что, когда один объектив используется для как для освещения, так и для обнаружения , у вас будет меньший доступный угловой диапазон, чем в геометрии с двумя или несколькими объективами.

Обеспокоенность рецензента тем, что мы используем три цели, опять же, на наш взгляд, является семантикой.В нашей настройке есть только одна цель, которая взаимодействует с образцом. Как упоминалось ранее, очевидно, что при использовании нескольких объективов для освещения и обнаружения образца можно получить больший доступ из большего углового диапазона за счет сложного интерфейса образца.

Стремясь сообщить об этом более эффективно, мы теперь заявляем, что «И в отличие от современных многоракурсных методов LSFM, которые достигают лучшего осевого разрешения после слияния изображений и деконволюции, требуется только одна перспектива изображения.”

Рецензент № 5:

В этой рукописи «Универсальный микроскоп с косой плоскостью для крупномасштабной визуализации субклеточной динамики с высоким разрешением», Sapoznik et al. описывают вариант микроскопа с наклонной плоскостью (OPM), в котором используется специально разработанный третичный объектив для захвата большей части испускаемых лучей через объективы с наклонной перефокусировкой. OPM в сочетании со световым листом является привлекательным, потому что он предлагает потенциал для получения изображений с низкой фототоксичностью с оптическими сечениями с использованием только одного основного объектива для визуализации с физическим доступом на 180 градусов.Как отмечают авторы, эта концепция сама по себе не нова, и многие описания и реализации были описаны ранее (первоначально с Dunsby в 2008 году, а в последнее время с Bouchard 2015 и Yang 2019). Таким образом, основным техническим нововведением здесь является реализация сплошной иммерсионной линзы индивидуальной конструкции.

В целом, я считаю, что это полезное дополнение к данной области и могло бы подойти для публикации в eLife. Действительно полезен световой микроскоп с открытым верхним светом с увеличенным доступом к образцам.Однако в нынешнем виде рукопись больше похожа на агрессивную коммерческую подачу, чем на сбалансированное обсуждение плюсов и минусов различных подходов к использованию микроскопа. Презентация чрезмерно пренебрегает предыдущей работой, часто неверно представляя или выискивая конкретные сравнения, чтобы этот текущий инструмент выглядел лучше, при этом не упоминаются или не обсуждаются компромиссы, при которых инструмент может работать хуже. Я заметил, что авторы раскрывают финансовые отношения с компаниями, которые продают продукты, которые конкурируют с коммерческими версиями многих инструментов, сравниваемых здесь.Однако я считаю, что читателям eLife было бы полезно, если бы авторы сосредоточились на более тщательном документировании своего собственного научного вклада вместе с его компромиссами, а не (часто неполностью или неточно) на характеристике предыдущей работы других.

Мы ценим то, что вы считаете это полезным дополнением к данной области, и согласны с вашим мнением о том, что световые микроскопы с открытым верхом действительно полезны. Мы не намеревались излишне пренебрегать предыдущими работами, а скорее четко очертить различия между нашей техникой и другими, что было необходимо для решения многих проблем, поднятых рецензентами в первой редакции этой рукописи.Важно отметить, что в отношении технологии OPM, описанной здесь, у нас нет конкурирующих финансовых интересов:

1) Мы работали с Applied Scientific Instrumentation над созданием многих оптических элементов и облегчили другим лабораториям создание собственных систем OPM. Тем не менее, эта договоренность была чисто бесплатной. У нас нет патентов на технологии OPM или SCAPE.

2) Discovery Imaging Systems, LLC была образована для продажи световых микроскопов для очищенных тканей, основанных на нашей технологии аксиальной световой микроскопии (ASLM).Однако это предприятие ожидает завершения, пока не будет получен патент на ASLM.

3) Остальные конкурирующие финансовые интересы носят фармацевтический характер и могут быть полностью отнесены на счет Drs. Карлос Артеага и Ариэлла Ханкер.

1) Заявленное здесь разрешение обеспечено измерениями FHWM изолированных шариков и измерениями xy (боковыми) с использованием подходов, основанных на корреляции изображений. Важно отметить, что оптическое сечение вообще не обсуждается. В этом приборе разрешение обеспечивается за счет основного объектива с высокой числовой апертурой, но из-за толстых световых листов (0.16 NA гауссовых лучей), используемых в большинстве измерений, световые полосы значительно толще, чем глубина резкости для обнаружения. Это было бы легко очевидно как «отсутствующий конус» в оптической передаточной функции, и я подозреваю, что это также повлияло бы на измерения осевого разрешения на основе корреляции, если бы они проводились на клетках или эмбрионах, а не на изолированных шариках. Напротив, осевое разрешение в некоторых других подходах (гауссовском, бесселевском, решетчатом и т. Д.) Достигается за счет использования светового листа, который является тонким по сравнению с глубиной резкости обнаружения.Собственная предыдущая работа авторов, Dean et al. 2015, подчеркнули преимущества этого подхода, но здесь нет упоминания о взаимосвязи между оптическим секционированием и разрешением.

Как известно этому обозревателю, все световые микроскопы сопровождаются сложными компромиссами, которые включают ограничение освещения, поле зрения, поперечное разрешение, осевое разрешение, чувствительность, скорость, оптическое сечение и т. Д. Однако недавние исследования показали, что наиболее широко используемые квадратные решетки не улучшают оптическое секционирование или осевое разрешение по сравнению с гауссовыми пучками (DOI: 10.1364 / OE.400164 и 10.1364 / BOE.11.000008), поэтому мы выбрали последнее.

На наш взгляд, наиболее многообещающими методами для улучшения оптического сечения, осевого разрешения и поля зрения является создание световых слоев с помощью двухфотонных бесселевых лучей, структурированного освещения или использование принципа ASLM, все из которых имеют существенные недостатки. В принципе, оба метода совместимы с нашим микроскопом, но мы еще не реализовали эти возможности в нашем микроскопе. Другие типы световых листов (гексагональная решетка, 1PE Bessel, лучи Эйри) имеют значительную потерю оптического ограничения.

Для большинства выполненных биологических изображений мы использовали гауссов пучок с эффективной числовой апертурой 0,16 и ожидаемой толщиной и конфокальным параметром 1,2 и 36,9 микрон соответственно. Хотя эта толщина больше, чем глубина резкости, мы хотели бы отметить, что она всего в ~ 1,33 раза больше. Теперь мы прямо упоминаем об этом при описании прибора следующим образом: «Для большинства биологических экспериментов, о которых здесь сообщается, мы использовали освещение с числовой апертурой 0,16, что давало гауссов пучок с толщиной и длиной распространения, равными 1.2 и 37 мкм соответственно. Важно отметить, что из-за того, что световой луч толще, чем глубина резкости обнаруживающего объектива, оптическое сечение (например, способность подавлять расфокусированную флуоресценцию) немного снижается ».

измерений FWHM по отдельности — это ограниченная картина разрешения. Авторы должны представить оптические передаточные функции в плоскостях xy, xz и yz, чтобы продемонстрировать истинное разрешение и насколько их система заполняет недостающий конус. Им также следует выполнить измерения корреляции на основе необработанных изображений в осевом измерении (как они уже делают сейчас для бокового измерения) на ряде биологических образцов.Это можно легко сделать с существующими данными.

Теперь мы представляем OTF на рис. 2 — дополнение к рисунку 1 и демонстрируем, что наша система действительно частично заполняет недостающий конус. Для сравнения мы также предоставляем широкопольный OTF, который ясно показывает сингулярность в начале координат и недостающий конус информации. По нашему мнению, существует огромная разница между OTF с широким полем поля и любой из показанных нами OTF со световым листом. Система с широким полем поля не может отвергать какой-либо фон и, следовательно, имеет в своем происхождении особенность, что затрудняет любые попытки деконволюции.

Из-за сложностей, возникших из-за коррелированного распределения шума современных КМОП-камер, вычислительного сдвига данных и формы параллелепипеда объема изображения, корреляции Фурье-оболочки оказались сложными и проблемно изменчивыми (мы потратили ~ 2 месяца, работая над этим. во время первого цикла доработки). Следовательно, мы предоставили анализ корреляции кольца Фурье и декорреляции боковых разрешений, и эти результаты в значительной степени согласуются с показателями FWHM и разрешения, основанными на частотном пространстве.Учитывая это согласие между подходами к измерениям разрешения в боковых измерениях, мы не видим причин, по которым осевое разрешение, измеренное в реальном пространстве, должно быть неточным.

2) Авторы описывают, что из-за оптического пути, необходимого для OPM, прибор теряет 71% фотонов от образца до того, как они попадут в камеру. I.E. КПД передачи составляет 29%. Это резко контрастирует со стандартными системами SPIM, которые из-за простой оптики с широким полем обнаружения должны работать с эффективностью передачи ~ 80-90% коммерческих объективов.Кроме того, неясно, под каким углом изображения было выполнено это измерение. Эта информация также важна, потому что эффективность снижается еще больше, поскольку основная цель используется дальше от ее стандартного проектного угла, равного 0 градусов. В приложении авторы описывают, как числовая апертура 1,2 в этой системе в некоторой степени компенсирует это плохое пропускание по сравнению с линзой 1,1 нА, используемой в других вариантах, но этот анализ предполагает, что все лучи имеют одинаковую эффективность передачи, что, как правило, неверно.Таким образом, даже без какой-либо дополнительной оптики система OPM, работающая со смещенным зрачком, будет иметь меньшую эффективность передачи, чем объектив с такой же эффективной числовой апертурой, работающей на оси.

В предыдущем представлении мы проводили измерения с наклоном 30 градусов. Мы более систематически повторили это измерение, тщательно согласовав диаметр юстировочного лазера с размером заднего зрачка первичного объектива, со всей оптикой и фильтрами, присутствующими на оптическом пути, за исключением первичного объектива и камеры.Варианты с лазером и сканированием столика имели пропускание 41% и 53% при ориентации под углом 30 градусов. Соответственно, комбинация сканирующих линз, гальванических и тубусных линз привела к дополнительному снижению пропускания между двумя системами на 12%. Установка варианта сканирования столика под углом 0 градусов улучшила передачу только на 3% до 56%. Это подтверждает конструктивные прогнозы для нашей третичной цели обнаружения (т. Е. Захват большей части светового конуса, исходящего от вторичной цели под умеренным углом наклона).Теперь мы подробно рассмотрим эти измерения в разделе «Материалы и методы».

Экспериментальная характеристика того, как эффективность передачи между объективом с числовой апертурой 1,2, работающим с центрированным зрачком, и объективом с более высокой числовой апертурой с эффективной числовой апертурой 1,2 из-за децентрализации зрачка с помощью OPM и соответствующей оптики, и как она уменьшается с углом OPM, будет чрезвычайно полезно для поля. Авторы идеально подходят для проведения таких измерений.

Тем не менее, это важное обсуждение, поэтому я не понимаю, почему измерения не упоминаются в основном тексте в разделе «Характеристики прибора».Вместо этого они представлены в четвертом абзаце раздела «Материалы и методы» в разделе «Настройка лазерного сканирующего микроскопа». Учитывая, что конечные пользователи микроскопов готовы платить на тысячи долларов больше за камеру с утонением сзади с увеличением квантовой эффективности на 10%, чем за устройство без утонения сзади, авторы должны упомянуть, что реализация OPM здесь достигается за счет снижения эффективности обнаружения в основной текст. Заявление о том, что прибор «достаточно чувствителен для обнаружения одиночных молекул (данные не показаны)» не решает эту проблему должным образом.Особенно, когда другие подходы ясно продемонстрировали свою полезность для визуализации живых клеток и одиночных молекул со сверхвысоким разрешением как с красителями, так и с флуоресцентными белками. Также непонятно, как авторы определяют «без явных признаков фототоксичности». Как это было измерено и что считается очевидным?

В последнем абзаце Обсуждения мы упоминаем снижение эффективности сбора. Также мы удалили утверждения об обнаружении одиночных молекул и фототоксичности.

3) Меня беспокоит, как обсуждаются предыдущие методы. Например, решетчатая световая микроскопия — это не отдельный инструмент, а общее описание использования схем возбуждения на основе оптических решеток для микроскопии. Конкретный выбор возбуждающего объектива и детектирующего объектива, а также тип решетчатого светового полотна и степень используемого оптического ограничения будут определять разрешение и оптическое сечение и могут быть выбраны / оптимизированы для конкретных приложений.Таким образом, утверждения типа «микроскопия решетчатого светового листа имеет разрешение xx» или «требуется покровное стекло толщиной 5 мм» не более точны, чем утверждение «микроскопия с гауссовым лучом имеет разрешение xx и требует заливки образца агарозы». Все зависит от того, как человек решает настроить инструмент и для какой цели он выбирает баланс между компромиссами. Можно сказать, что конкретная публикация сообщила об определенных значениях, но это должно сопровождаться определенным контекстом. Во многих случаях соображения дизайна могли быть выбраны для создания инструмента, оптимизированного для другой цели или с дополнительными функциями, чем тот, который представлен здесь.

Теоретически решетчатый световой лист — это общий подход к визуализации, который совместим с целым рядом объективов и, следовательно, с подготовкой образцов. Однако на практике он изготавливается и продается таким образом, что требуется покровное стекло толщиной 5 мм. Вот как это было реализовано Betzig, 3i и более чем 120 различными лабораториями. Кроме того, способ описания светового листа Lattice в литературе затрудняет сравнение. Он может работать в режимах структурированного освещения, гексагонального и квадратного освещения, каждый с различными внутренними и внешними НУ, длиной луча, толщиной и т. Д.Для сравнения здесь мы ссылаемся на режим квадратного освещения, который составляет> 95% случаев использования (см. Таблицу S1, DOI: 10.1038 / s41592-01

-9), и который мы провели тщательные измерения (DOI: 10.1364 / ОЕ.400164). Теперь мы пытаемся указать, что мы ссылаемся на осевое разрешение квадратного режима освещения (поперечное разрешение остается неизменным). Кроме того, текст теперь гласит: «Подготовка образцов — это дополнительная проблема, поскольку ортогональная геометрия систем LSFM часто стерически закрывает стандартные чашки для визуализации, такие как многолуночные планшеты.”

определение наклонно по The Free Dictionary